İki ebeveyn formundan genetik materyal içeren genomların oluşum süreci. Bakterilerde konjugasyon, transformasyon, transdüksiyon sonucu gerçekleştirilir.

Rekombinasyonlar yasal ve yasadışı olarak ikiye ayrılır. Meşru rekombinasyon, rekombinasyon moleküllerinde genişletilmiş, tamamlayıcı DNA uzantılarının varlığını gerektirir. Yalnızca yakından ilişkili mikroorganizma türleri arasında meydana gelir.

Yasadışı rekombinasyon, genişletilmiş tamamlayıcı DNA bölgelerinin varlığını gerektirmez.

Dönüşüm- serbest bir DNA molekülünün bir organizmanın hücresi tarafından çevreden emilme süreci ve genoma entegrasyonu, bu tür bir hücrede DNA donör organizmasının yeni kalıtsal özelliklerinin ortaya çıkmasına yol açar. Donör kabul edebilen hücreler
DNA'ya yetkin denir. Yeterlilik durumu uzun sürmez. Bakteri kültürünün belirli bir büyüme döneminde meydana gelir. Yeterlilik durumunda, bakteri hücre duvarı yüksek polimerli DNA fragmanlarına karşı geçirgen hale gelir. Görünüşe göre bunun nedeni, dönüştürülmüş DNA fragmanının proteine ​​bağlanarak bakteri hücresine aktarıldığı bir transformasom oluşturmasıdır. Dönüşüm süreci:

1). Donör DNA'sının alıcı hücreye adsorpsiyonu.

2) DNA'nın alıcı hücreye nüfuz etmesi;

3) Alıcı kromozomun homolog bir bölgesi ile DNA bağlantısı ve ardından rekombinasyon.

Hücreye nüfuz ettikten sonra, dönüştürücü DNA despire olur. Daha sonra, donörün DNA'sının iki şeridinden herhangi biri fiziksel olarak alıcının genomuna dahil edilir.

İletim- Bakteriyel DNA'nın bir bakteriyofaj aracılığıyla bir hücreden diğerine aktarılması işlemi.

spesifik olmayan: fajların dönüştürülmesi yalnızca bir bakteriden diğerine genetik materyalin taşıyıcısıdır, çünkü faj DNA'sının kendisi rekombinantların oluşumunda yer almaz.

Özel: Bir fajın belirli genleri donör bakteriden bir bakteriye aktarma yeteneği ile karakterize edilen -
alıcıya.

abortif: Fajın getirdiği donör bakterinin DNA fragmanı, alıcı bakterinin kromozomunda yer almaz, sitoplazmada bulunur.

Konjugasyon- iki bakteri hücresinin doğrudan teması yoluyla genetik materyalin bir kısmının tek yönlü transferi.

İlk aşama, donör hücresinin cinsiyet villusunu kullanarak alıcı hücreye bağlanmasıdır. Daha sonra, her iki hücre arasında, F faktörünün ve donör bakterisinin sitoplazmasında özerk bir durumda bulunan diğer plazmitlerin kullanılabileceği bir konjugasyon köprüsü oluşturulur. verici hücreden alıcı hücreye aktarılır.

16) Biyoteknoloji- teknolojik sorunları çözmek için canlı organizmaları, sistemlerini veya hayati faaliyetlerinin ürünlerini kullanma olanaklarını ve ayrıca genetik mühendisliğini kullanarak gerekli özelliklere sahip canlı organizmalar yaratma olasılığını inceleyen bir disiplin.

Aşı suşlarının elde edilmesine yönelik yöntemlerden biri, genetik mühendisliği yöntemidir (patojenik mikropların virülans faktörlerinin oluşumundan sorumlu olan genin etkisizleştirilmesi).

No, Vektör rekombinant aşılar genetik mühendisliği ile elde edilmiştir. Bunu yapmak için, aşı suşunun genomuna, başka bir patojenin (yabancı antijen) antijenlerinin oluşumunu kontrol eden bir gen (vektör) eklenir. Örneğin, hepatit B virüsü antijeni (HBs - antijen), çiçek aşısı virüs suşunun içine eklenir. Bu vektör aşısı hem çiçek hastalığına hem de hepatit B'ye karşı bağışıklık sağlar.

Moleküler aşılar da yapılıyor genetik mühendisliği tarafından. Antijenleri maya hücreleri tarafından sentezlenen hepatit B'ye karşı bir aşı bu şekilde elde edildi.

17) Sıcaklık - önemli faktör Mikroorganizmaların yaşamını etkiler. Mikroorganizmalar için minimum, optimal ve maksimum sıcaklıklar vardır. Optimum– mikropların en yoğun çoğalmasının meydana geldiği sıcaklık. Asgari– Altında mikroorganizmaların hayati aktivite göstermediği sıcaklık. Maksimum- Mikroorganizmaların ölümünün gerçekleştiği sıcaklık.

Olumlu eylem optimum sıcaklık Mikroorganizmaların yetiştirilmesinde kullanılır amaç için laboratuvar teşhisi, aşıların ve diğer ilaçların hazırlanması.

Frenleme eylemi düşük sıcaklıklar depolama için kullanılır buzdolabındaki mikroorganizmaların ürünleri ve kültürleri. Düşük sıcaklık, paslanma ve fermantasyon işlemlerini durdurur. Düşük sıcaklıkların etki mekanizması, hücredeki metabolik süreçlerin engellenmesi ve askıya alınmış bir animasyon durumuna geçiştir.

Zararlı etki yüksek sıcaklık (maksimumun üstünde) sterilizasyon için kullanılır . Mekanizma eylemler – proteinin (enzimlerin) denatürasyonu, ribozomların hasar görmesi, ozmotik bariyerin bozulması. Psikrofiller ve mezofiller yüksek sıcaklıklara en duyarlı olanlardır. özel sürdürülebilirlik göstermek anlaşmazlıklar bakteriler.

Fiziksel yöntemler: sterilizasyon yüksek sıcaklık, UV ışınlaması, iyonlaştırıcı ışınlama, ultrason, steril filtrelerden filtreleme.

Pastörizasyon - kısmi nispeten düşük bir sıcaklıkta gerçekleştirilen sterilizasyon (sporlar öldürülmez) bir kere. Pastörizasyon 70-80°C'de 5-10 dakikada veya 50-60°C'de 15-30 dakikada gerçekleştirilir. Pastörizasyon, örneğin yüksek sıcaklıklarda kalitesini kaybeden nesneler için kullanılır. kullanmak İçin bazı gıda ürünleri: süt, şarap, bira . Bu onlara zarar vermez emtia değeri ancak sporlar canlı kaldığından bu ürünlerin buzdolabında saklanması gerekir.

Sterilizasyon kontrolü.

Son yıllarda faktörlerin etkisine karşı oldukça dirençli olan mikroorganizmaların yayılması nedeniyle çevre Sterilizasyon ve kalite kontrol yöntemleri sıkılaştırılıyor.

Sterilizasyonu kontrol etmek için aşağıdakiler kullanılır:

1. Fiziksel yöntemler– maksimum ve temas termometreleri.

2. Kimyasallar Sıcaklık göstergeleri olarak. Bunlar kesin olarak tanımlanmış bir erime noktasına sahip toz halindeki maddelerdir: benzonaftol (110°C), antipirin (113°C), resorsinol ve kükürt (119°C), benzoik asit (120°C). Bu maddeler az miktarda kuru anilin boya (macenta, metilen mavisi) ile karıştırılarak sterilize edilecek nesnelerin arasına yerleştirilen ağzı kapalı cam tüplere yerleştirilir. Bu yöntem sterilizasyon rejimini kontrol etmek için kullanılır bir otoklavda. Otoklavdaki sıcaklık yeterliyse tüpteki madde erir ve bu madde içinde çözünen boyanın rengine döner.

3. Biyolojik yöntemler– ısıya dayanıklı spor oluşturucu ajanın kullanılması kültür testi – Bacillus stearothermophilus. Sporları 1 ml besiyerinde 106 hücre içerdiğinde 121°C'de 15 dakikada ölür. Sterilizasyon rejimini izlemek için biyolojik bir test kullanılır Pasteur'ün fırınında . Sporlarla kirlenmiş gazlı bez şeritleri, filtre kağıdı ve ipek iplik içeren test tüpleri, sterilize edilen öğelerin arasındaki bir kabine yerleştirilir. Sterilizasyondan sonra test tüpüne besin suyu eklenir ve mikroorganizmaların büyümesi gözlemlenir.

18) Akan buharla sterilizasyon.

Yöntem dayanmaktadır Buharın (100°C) yalnızca bitkisel hücrelere karşı bakterisidal etkisi üzerine.

Teçhizat– vidasız kapağı olan bir otoklav veya Koch aparatı.

Koch aparatı - Bu, boşluğun 2/3'ü suyla dolu, çift tabanlı metal bir silindirdir. Kapakta termometre ve buharın çıkması için delikler bulunur. Dış duvar, ısıyı zayıf ileten bir malzeme (linolyum, asbest) ile kaplanmıştır. Sterilizasyonun başlangıcı, suyun kaynamasından ve buharın sterilizasyon odasına girmesinden itibaren geçen süredir.

Malzeme ve sterilizasyon modu Bu yöntem, 100°C'nin üzerindeki sıcaklıklara dayanamayan malzemeleri sterilize etmek için kullanılır: vitaminler, karbonhidratlar (Hiss, Endo, Ploskirev, Levin ortamı), jelatin, süt içeren besin ortamları.

100°C'de sporlar ölmez, dolayısıyla sterilizasyon birkaç kez gerçekleştirilir - fraksiyonel sterilizasyon - 3 gün boyunca günde 20-30 dakika.

Sterilizasyonlar arasındaki aralıklarla, sporların bitkisel formlara dönüşmesi için malzeme oda sıcaklığında tutulur. Daha sonra 100°C'ye ısıtıldıklarında öleceklerdir.

Tyndalizasyon ve pastörizasyon.

Tyndalizasyon - 100°C'nin altındaki sıcaklıklarda fraksiyonel sterilizasyon yöntemi. Nesneleri sterilize etmek için kullanılır, 100°C'ye dayanamayan: serum, asit sıvısı, vitaminler . Tyndallizasyon 5-6 gün boyunca 1 saat süreyle 56°C'deki su banyosunda gerçekleştirilir.

İlgili bilgiler.

Prokaryotlarda rekombinasyon. Dönüşüm. Konjugasyon. Transdüksiyon. Prokaryotlarda genetik harita oluşturmanın özellikleri.

Genetik rekombinasyon

Sonuç olarak prokaryotlarda genotipik değişkenlik gözlenir rekombinasyon iki hücrenin genomlarının kısmi birleşiminden kaynaklanan gen materyali ve bakteri fenotipinde kendini gösterir. Transformasyon, transdüksiyon ve konjugasyon, prokaryotların genetik materyalinde rekombinatif değişkenliğe yol açar.

Cinsel süreç sırasında her iki ebeveynin genetik materyalini birleştirerek gerçek bir zigotun oluştuğu ökaryotlardan farklı olarak, prokaryotlarda yukarıdaki süreçlerin üçü sırasında da genetik materyalin donör hücresinden alıcıya yalnızca kısmi transferi gerçekleşir. hücre gözlenir, bu da -iyu kusurlu zigota yol açar – merozigotlar. Böylece, prokaryotik alıcı hücre kısmen diploid hale gelir, esas olarak alıcı hücrenin genotipini korur ve donör hücrenin yalnızca belirli özelliklerini kazanır.

Rekombinasyonun sorumluluğu, alıcı hücrenin özel genlerine aittir. kayıt genleri. Rekombinasyon mekanizması şunları içerir: birbirini takip eden bir dizi aşama:
1) alıcı hücrenin DNA iplikçiklerinin kırılması;
2) donör hücresinden aktarılan DNA fragmanlarının alıcı hücrenin genomuna entegrasyonu;
3) değiştirilmiş genoma sahip hücrelerin yavrularına yol açan rekombinatif DNA'nın replikasyonu.

Yukarıdaki rekombinasyon mekanizmasının kanıtı, fosfor (P 32) etiketli donör hücreleri kullanılarak Escherichia coli'nin (E. coli) konjugasyon sürecinin incelenmesiyle deneysel olarak elde edildi.

Dönüşüm(Latince'den - dönüşüm) - serbest DNA'nın bir parçası çevreden hücreye girdiğinde bilgi aktarımının bir sonucu olarak bakterilerin genomunda ve özelliklerinde bir değişiklik. Transformasyon, donör hücre ile alıcı hücre arasında doğrudan temas gerektirmez. Dönüştürücü DNA'nın kaynağı, yeni öldürülmüş bir bakteri kültürü veya bundan ekstrakte edilen saf DNA preparatları olabilir.

Bakterilerdeki dönüşüm olgusu ilk kez 1928'de F. Griffiths tarafından gözlemlendi. Griffiths, öldürülen öldürücü kapsüler pnömokok S-tipi ve canlı avirülent akapsüler pnömokok R-tipinin farelerin vücuduna birlikte verildiğinde tüm hayvanların öldüğünü keşfetti. Bu durumda, ölü farelerin kanından R tipi akapsüler pnömokoklarla birlikte S tipi virülan kapsüler pnömokok izole edilir. Griffiths dönüşüm olgusunu açıklayamadı. Ancak 1944'te O. Avery, K. McLeod ve M. McCarthy, öldürülmüş kapsüler pnömokok hücrelerinden dönüştürücü bir madde izole ettiler ve bunun DNA polimeraza karşı DNA'ya duyarlı olduğunu gösterdiler.

Dönüşüm süreci şu şekilde gerçekleşiyor: birkaç aşama:
1) transforme edici DNA'nın yetkin bir alıcı hücrenin yüzeyine adsorpsiyonu;
2) ortalama molekül ağırlığı (4-5)·106 olan fragmanların oluşumuyla transforme edici DNA'nın enzimatik bölünmesi;
3) DNA zincirlerinden birinin bozulması ve tek iplikli fragmanların oluşumu ile birlikte DNA fragmanlarının alıcı hücreye nüfuz etmesi;
4) entegrasyon – dönüştürücü DNA parçalarının gen değişimi yoluyla alıcı hücrenin DNA'sına dahil edilmesi;
5) ekspresyon - yavruları DNA molekülünde değiştirilmiş bir gene sahip olacak olan dönüştürülmüş hücrelerin yoğun şekilde çoğaltılması.

Dönüştürücü DNA fragmanı tipik olarak bakteri kromozomunun %0,3'üne veya yaklaşık 15 gene karşılık gelir. Çok küçük bir DNA parçası alıcı hücreye nüfuz eder, bu da yalnızca bir özelliğin ve nadiren iki özelliğin dönüşümüne neden olur. Bir hücreden diğerine dönüşüm yoluyla bakterilerin ilaçlara direnç, kapsüler polisakkaritleri, enzimleri, bazı metabolitleri sentezleme yeteneği vb. gibi özellikleri aktarılabilir. Dönüşüm sırasında niteliksel olarak yeni bir kalıtsal özellik eklenmez; yalnızca bir özelliğin diğeriyle yer değiştirmesi gözlemlenir.

İletim Genetik materyalin bir donör hücreden alıcı bir hücreye ılımlı bir bakteriyofaj tarafından aktarılmasından oluşur. Transdüksiyon olgusu, 1952'de N. Zinder ve J. Lederberg tarafından iki Salmonella suşu örnek olarak kullanılarak keşfedildi.

Bakteriyel hücre ile etkileşim mekanizmasına göre fajlar öldürücü ve orta dereceli olarak ayrılır. Hücreye nüfuz eden öldürücü fajlar, yeni fajların oluşumuna ve bakterilerin parçalanmasına neden olur. Hücrelerin ılıman fajlar tarafından enfeksiyonuna her zaman bakterilerin parçalanması eşlik etmez; bunların bazıları hayatta kalır ve lizojenik hale gelir. Lizojenik bakterilerde fajın DNA'sı, DNA hücrelerine dahil edilir ve ılıman sıcaklıktaki faj, bakteri hücresini parçalama yeteneğini kaybederek profaja dönüşür. Profaj, bakteri kromozomunun bir parçası gibi davranır ve birkaç nesil boyunca onun içinde çoğalır. Ilıman fajların lizojenik bakteri hücrelerinden salınması kendiliğinden veya lizojenik bakterilerin etkisi altında meydana gelir, kendiliğinden veya indüklenen ajanların - ultraviyole ışınları, iyonlaştırıcı radyasyon ve kimyasal mutajenlerin etkisi altında meydana gelir.

Bazı ılıman fajların üreme süreci sırasında bakteri kromozomunun küçük bir parçası faj genomuna dahil edilir. Dönüştürücü faj, önceki konakçıdan bir DNA parçasını ona duyarlı yeni bir bakteri hücresine aktarır. Böylece alıcı bakteri hücresi kısmi bir zigot haline gelir.

Bakteriler ayırt ediliyor 3 tip transdüksiyon: uzmanlaşmış, genel ve sonuçsuz.

Uzmanlaşmış- faj genomu, doğrudan profajın yanındaki bakteriyel kromozom üzerinde yer alan, donör bakterisinin kesin olarak tanımlanmış DNA genlerini içerir. Profajın yanındaki genler bakteri kromozomundan ayrılır ve profaj genlerinin bir kısmı bileşiminde kalır. Donör hücresinden salınan kusurlu fajların transdüksiyonu, alıcı hücrenin lizogenezine neden olur. Kusurlu fajın DNA'sı, alıcı hücrenin kromozomuna dahil edilir ve ona donör bakterisinin genleri eklenir.

Genel- Donör bakterisinin herhangi bir DNA fragmanının faj DNA'sına dahil edilmesi bakımından uzmanlaşmış olandan farklıdır. Böylece, genel transdüksiyon sırasında, transdüksiyon fajları, çeşitli özellikleri kontrol eden genleri donör bakterinin kromozomundan alıcı bakterinin hücresine aktarır.

abortif - Dönüştürücü bir faj tarafından bir alıcı hücreye sokulan bir donör hücresinin kromozomunun bir parçası, kromozomuna dahil edilmez, ancak sitoplazmada lokalize olur ve alıcı hücre bölündüğünde, ortaya çıkan hücrelerden yalnızca birine aktarılır.

Deneyde transdüksiyon bağırsak bakterileri, psödomonadlar, stafilokoklar, basiller ve aktinomisetler üzerinde gösterilmiştir. Transdüksiyon, yeni özelliklere ve dirence sahip bakteri türlerinin ortaya çıkmasını belirler. ilaçlar, enzimlerin, amino asitlerin vb. sentezi.

Genetik mühendisliği deneylerinde transdüksiyon, yalnızca bakterilerin türler arası hibridizasyonu için geniş olanaklar sağlamakla kalmaz, aynı zamanda bakteriler arasında hibridler elde etme olasılığını da açar. farklı gruplar prokaryot.

Konjugasyon Bakteri hücrelerinin doğrudan teması yoluyla meydana gelir ve genetik materyalin donör hücresinden alıcı hücreye yönlendirilmiş transferini içerir. Konjugasyon olgusu 1946'da J. Lederberg ve E. Tatum tarafından Escherichia coli (E. coli) suşu K 12 örneği kullanılarak tanımlandı.

Bakterilerin konjuge olma yeteneği, konjugatif plazmidlerden biri olan seks faktörü F faktörünün varlığıyla ilişkilidir. F faktörünü taşıyan hücreler F+ olarak adlandırılır; F faktörü eksik olan hücreler - F¯ . F+ hücrelerindeki F faktörü (F plazmidi) genellikle bakteri kromozomundan izole edilmiş bir haldedir ve sitoplazmik bir yapıdır. F-faktörü içeren bakteri hücreleri bir dizi özellik bakımından diğer hücrelerden farklılık gösterir: değişen yüzey yükü ve F-pili'nin ek yüzey yapılarını sentezleme yeteneği.

Konjugasyon süreci, donör hücresinin F pili ucunun alıcı hücreye bağlanmasıyla başlar. Birkaç dakika içinde donör hücre ile alıcı hücre, muhtemelen F-pili'nin kasılması nedeniyle birbirine yaklaşarak doğrudan temasa geçer. F-pili kanalı yoluyla sitoplazmik köprü yoluyla, 5 dakikadan daha kısa bir sürede, seks faktörü F-faktörü, bakteriyel kromozomdan bağımsız olarak, F + donör hücresinin sitoplazmasından F ¯ alıcı hücresinin sitoplazmasına aktarılır. . Bu durumda donör hücresi, F faktörünün kopyaları içinde kaldığı için donör yeteneğini kaybetmez.

F + hücrelerinin popülasyonu arasında, konjugasyon sırasında F faktörünü değil, bakteri kromozomunun bir parçasını iletebilen bakteriler vardır. Bu bakteri hücreleri ve ürettikleri türler, yüksek rekombinasyon sıklığına sahip bakteriler anlamına gelen Hfr (yüksek frekanslı rekombinasyon) olarak adlandırılır. Hfr hücreleri ile F¯ hücreleri arasındaki rekombinasyonlar, F+ ve F¯ hücreleri arasındaki rekombinasyonlardan bin kat daha sık meydana gelir. Hfr hücreleri ile F+ hücreleri arasındaki fark, cinsiyet faktörü F'nin bakteri kromozomunda yer almasıdır. Konjugasyon sırasında Hfr donör hücresinde DNA replikasyonu meydana gelir. Bu durumda replikasyon yapan DNA zincirlerinden biri bir konjugasyon köprüsü üzerinden F¯ alıcı hücresine girer, ikincisi Hfr donör hücresinde kalır ve ardından bu zincirlerin her biri tamamlayıcı bir zincirle tamamlanır. Konjugasyon köprüsü kırılgandır, kolayca kırılır, bu nedenle kromozomun tamamı değil, yalnızca bir kısmı Hfr donör hücresinden F¯ alıcı hücresine aktarılır.

Hfr hücresinden aktarılan kromozom parçası ile F hücresinin kromozomunun homolog bölgesi arasında genetik değişim meydana gelir. Sonuç olarak, donör DNA'sının bir kısmı alıcı DNA'sına entegre edilir ve alıcı DNA'sının karşılık gelen kısmı bunun dışında bırakılır. Donör DNA'sının alıcı kromozomuna dahil edilme verimliliği yüksektir ve yaklaşık 0,5'tir.

Prokaryotların konjugasyonu ökaryotların cinsel süreci ile tanımlanmamalıdır, çünkü konjugasyon sırasında F + hücresinin genetik materyalinin yalnızca bir kısmı F hücresine aktarılır ve bu da alt merozigot oluşumuna neden olur. İkincisinin temeli, verici hücrenin genomunun bir kısmı ile birlikte alıcı hücrenin genomudur.

Kalıtsal özelliklerin stabilitesi ve doğruluğunun yanı sıra, prokaryotların genetik aparatı, mutasyonlar ve rekombinasyonlar şeklinde kendini gösteren değişkenlik ile karakterize edilir.

Prokaryotların spontan mutasyonları, DNA'larının genetik yapı olarak işleyişinin başlangıcına paralel olarak ortaya çıkan ilk değişkenlik türü olarak düşünülmelidir. Milyonlarca yıl boyunca prokaryotlardaki tek varyasyon mekanizmasının mutasyonlar olması mümkündür.

Prokaryotların evriminde bir sıçrama, vericinin ve alıcının iki prokaryotik hücresinin genetik bilgisinin kısmen birleşmesinden oluşan rekombinatif değişkenliğin ortaya çıkmasıydı. O. doğal seçilim için evrim sürecini hızlandıran yeni ek materyal ortaya çıktı. Yukarıda tartışılan üç rekombinatif süreçten en mükemmel olanı konjugasyondur çünkü iki hücre arasında genetik bilgi alışverişinin daha eksiksiz olmasını sağlar. İki E. coli hücresinin uzun süreli (90 dakika) konjugasyonu sırasında donör hücresinin tüm kromozomunun alıcı hücreye girdiğinin gözlemlendiği bilinen durumlar vardır.

Genetik rekombinasyonların etkinliği yalnızca tür içinde akraba olan yakın akraba bakteriler için yüksektir.

Prokaryotlarda genetik harita oluşturmanın özellikleri

Prokaryotlarda gen haritaları oluşturmak için bu fenomen kullanılır çekim– özel dairesel DNA molekülleri (plazmitler, özellikle F-plazmit kullanılarak) kullanılarak genetik materyalin bir hücreden diğerine aktarılması.

Belirli bir genin alıcı hücreye aktarılma olasılığı, F-plazmid DNA'sından veya daha kesin olarak F-plazmid DNA'sının replikasyonunun başladığı O noktasından uzaklığına bağlıdır. Konjugasyon süresi ne kadar uzun olursa, belirli bir genin transfer olasılığı da o kadar yüksek olur. Bu, konjugasyondan birkaç dakika sonra bakterilerin genetik haritasını oluşturmayı mümkün kılar. Örneğin Escherichia coli'de thr geni (treonin biyosentezini kontrol eden üç genden oluşan bir operon) sıfır noktasında (yani doğrudan F-plazmid DNA'nın yanında) bulunur, lac geni 8 dakika sonra aktarılır, recE geni - 30 dakika sonra, argR geni - 70 dakika sonra vb.

mikrop sindirim enfeksiyonu

Rekombinasyon, farklı molekülleri parçalayıp birleştirerek genetik materyalin değiştirilmesi işlemidir. Rekombinasyon, DNA'daki çift sarmallı kırılmaları onarmak ve ökaryotlarda, bakterilerde ve arkelerde replikasyon çatalı durduğunda replikasyonun devam etmesini sağlamak için meydana gelir. Virüsler genomlarındaki RNA molekülleri arasında yeniden birleşebilir.

Ökaryotlardaki rekombinasyon genellikle mayoz bölünme sürecinde, özellikle hayvanlarda sperm ve yumurta oluşumu sırasında geçiş sırasında meydana gelir. Rekombinasyon, DNA replikasyonu, RNA transkripsiyonu ve protein translasyonu ile birlikte temel, erken homolog rekombinasyonlardan biridir.

Homolog rekombinasyon

Homolog rekombinasyon türlerinin sınıflandırılması: alelik, ektopik ve homeolog; karşılıklı (geçiş) ve karşılıklı olmayan (gen dönüşümü).

Karşılıklı rekombinasyon. Geçişin doğasına ilişkin ilk fikirler: "kır ve birleştir" ve "seçici kopyalama" hipotezleri. Meselson'un "kır ve birleştir" mekanizmasını kanıtlamaya yönelik deneyleri. Rekombinasyonun moleküler mekanizmalarının incelenmesine yönelik metodolojik yaklaşımların geliştirilmesi. Rekombinant DNA oluşumunun iki aşaması: “eklem” ve birincil rekombinant moleküller.

Bakteriyofajlarda homolog rekombinasyonun genetik kontrolü. Bakteriyofaj l'deki Kırmızı sistem. Eksonükleaz l. Orf sistemi. Bakteriyofaj T4: 30, 32, 43, 46, 47, 49 ve uvsX genlerinin rolü. Rekombinasyon reaksiyonlarının enzimolojisi: endo ve eksonükleazlar, DNA polimeraz, DNA ligaz, UvsX proteini, SSB proteini ve diğer proteinler. “İplik yer değiştirmesi”, D-halka oluşumu, “dal göçü”, heterodubleks düzeltme süreçleri. Geçişin ana aşamaları şunlardır: presinapsis, sinapsis ve postsinapsis. Bakteriyofajlarda geçiş kalıpları. Rekombinasyon ve DNA onarımı süreçlerinin ortaklığı.

Homolog rekombinasyonun temel modelleri. Tatil modeli. Modelin önkoşulları, özü, anlamı. Daha sonraki çalışmalarda modelin geliştirilmesi, mevcut durumu. Meselson-Okuma modeli. Geçiş ve dönüşümle ilgili olarak mayada DNA çift iplik kopması (DSB) onarımının modeli (Zhostak ve diğerleri).

Bakterilerde kromozomal DNA'nın dönüşümü sırasında rekombinasyon. Rekombinasyon parametreleri. Entegre donör DNA fragmanlarının boyutları. Dönüşümün kinetiği ve verimliliği. Donör DNA'sının tek sarmallı fragmanlarının entegrasyonunun kanıtı. Bacillus subtilis ve Streptococcus pneumoniae'de genetik kontrol ve dönüşüm sürecinin ana aşamaları. Donör-alıcı kompleksi. Haemophilus influenzae'de transformasyon sırasında genetik kontrol ve rekombinasyon mekanizması. Transformozom.

Konjugasyon sırasında rekombinasyon Escherichia coli. Konjugatif DNA transferinin özellikleri. Donör DNA'sının alıcı hücrenin kromozomuna entegrasyon mekanizmaları.

E. coli'de homolog rekombinasyonun genetik kontrolü. Presynapsis'te yer alan genler: recA, recB, recC, recD, recE, recJ, vb. recB ve recC mutasyonlarının pleiotropik etkisi. ATP'ye bağımlı RecBCD nükleazı, aktiviteleri, etki mekanizmaları ve çeşitli genetik süreçlerdeki rolleri. Bir rekombinasyon sıcak noktası olarak Chi bölgesi. Bakteriler için ATP'ye bağımlı nükleazların çok yönlülüğü. Sinaps sürecini kontrol eden genler: recA, recF, recO, recR, ssb, vb. recA mutantlarının özellikleri. RecA proteini, özellikleri. RecA proteini tarafından katalize edilen reaksiyonlar; geçiş sürecinin ilk aşamalarındaki anahtar rolü: presinapsis ve sinaps. Homolog rekombinasyon sırasında sinapsın doğası. RecA DNA filamentleri, yapıları ve rekombinasyondaki fonksiyonları. RecBCD nükleaz ve RecA proteininin katılımıyla E. coli'de geçiş şeması. Diğer prokaryotik ve ökaryotik organizmalardaki RecA homologları. SSB proteininin rolü. Postsynapsis genleri: ruvA, ruvB, ruvC, recG ve bunların ürünleri. Holliday hemichiasma'sının göçündeki rolü ve çözümü.

Baskılayıcı mutasyonlar sbcA, sbcB, sbcC ve sbcD. Eksonükleazlar I ve VIII. SbcCD nükleaz. Clark'a göre E. coli K-12'de kromozomal DNA rekombinasyonunun üç yolu: RecBCD, RecF ve RecE, bunların özellikleri. Plazmidlerin homolog rekombinasyonunda RecF ve RecE yollarının rolü.

Ökaryotlarda geçiş sürecinin özellikleri. Mayotik geçiş. Sinaptonemal kompleksin rolü. Mayotik rekombinasyonun genetik kontrolü. Ökaryotlarda RecA benzeri proteinlerin (rekombinazlar) çeşitliliği.

Mitotik geçiş: karşılıklı ve karşılıklı olmayan rekombinasyon arasındaki ilişki. G1 hücrelerinde geçiş. Saccharomyces mayasında mayotik ve mitotik geçişin genetik kontrolündeki farklılıklar.

Ökaryotlarda rekombinasyon sıcak noktaları. Mayotik ve mitotik geçişin başlatılmasında DNA DNR'nin rolü.

Mayadaki kromozomal ve plazmid DNA'daki DNR'lerin rekombinasyon onarımı. Genetik kontrol ve mekanizmaların çeşitliliği: Zhostak ve arkadaşlarının modeli ve modifikasyonları, "kırma ve kopyalama" mekanizmaları, "tamamlayıcı DNA şeritlerinin bağlanması" ("tek iplikli tavlama"), "homologa bağlı ligasyon".

Ektopik rekombinasyon, genetik kontrolü, moleküler mekanizmalar ve biyolojik önemi.

Gen dönüşümü (rekombinasyon heterodubleksinin düzeltilmesi). İntragenik rekombinasyonun karşılıklı olmaması. Eşlenmemiş baz düzeltme hipotezi (Halliday). E.coli'deki heterodubleksler için genetik kontrol ve düzeltme yolları. Heterodublekste uzatılmış boşlukların oluşumu ve inşası ile eşleşmemiş bazların onarımı için sistemler. Mut HLSU sistemi, özellikleri. MutHLSU sistemini içeren heterodubleks düzeltmenin moleküler modeli. MutL ve MutS proteinlerinin evrimsel korunması. MutL ve MutS proteinlerinin eşleşmemiş bazların düzeltilmesi süreçlerinde ve homeolog rekombinasyonun düzenlenmesindeki rolü. Kısa boşlukların oluşumu ve inşası ile E.coli'deki eşleşmemiş bazların düzeltilmesine yönelik sistemler. Bakteriyel transformasyon sırasında heterodublekslerin düzeltilmesi, genetik kontrolü (Hex sistemi), genetik haritalamanın sonuçlarına etkisi. Düzeltme ve yüksek negatif girişim.

Ökaryotlarda gen dönüşümü. Allelik çaprazlamaların tetrad analizi. Defter türleri. Dönüşümün kutupluluğu, nedenleri. Ortak dönüşüm. Dönüşüm bölümünün uzunluğu. Mayotik dönüşüm ile yan işaretleyicilerin karşılıklı rekombinasyonu arasındaki bağlantı sorunu. Mitotik alelik gen dönüşümü. Ektopik mayotik ve mitotik dönüşüm. Homotalik mayadaki MAT lokuslarının değiştirilmesi. Maya ve insan örnekleri kullanılarak ekaryotlarda gen dönüşümünün genetik kontrolü. MutL ve MutS bakteriyel proteinlerinin ökaryotik homologları - PMS, MHL, MHS vb. protein aileleri, bunların rekombinasyon ve diğer hücresel süreçlerdeki işlevleri. MutL ve MutS bakteriyel proteinlerinin çeşitli homologlarının katılımına dayanan, ökaryotlardaki uyumsuzluk düzeltme sistemlerinin karmaşıklığı.

Evrim ve intogenezde dönüşümün rolü. Çeşitli genetik sistemlerde geçiş ve dönüşüm süreçleri arasındaki ilişki. Geçişten bağımsız olarak gerçekleşen dönüştürme işlemleri.

Sinaps için homoloji gerektirmeyen rekombinasyon süreçleri

Siteye özgü rekombinasyon. Prokaryot ve ökaryotlarda bölgeye özgü rekombinasyon sistemlerinin dağılımı, işlevleri. Bakteriyofajlarda, bakterilerde ve mayada bölgeye özgü rekombinasyonun anahtar proteinleri olarak bölgeye özgü topoizomerazlar tip I. Bölgeye özgü topoizomeraz I'in iki ailesi, integrazlar ve resolvazlardır.

Faj l'in entegrasyonu ve eksizyonu sırasında bölgeye özgü rekombinasyon. Campbell'in planı. Bitkisel faj ve profajın genetik haritaları arasındaki farklar. attP ve attB sitelerinin yapısı. Sistem Dış. İntegraz ailesinin bir temsilcisi olarak Int proteini. E. coli IHF proteini. Intasoma. Faj l'in entegrasyon ve eksizyonunun moleküler modeli. Sinaps sırasında att bölgelerinin antiparalel hizalanması. Bölgeye özgü rekombinasyon sırasında sinapsın doğası.

Bakteriyofajlarda ve bakterilerde (Din sistemi) ve mayada bölgeye özgü DNA inversiyonları. Anahtar rekombinasyon proteinleri, resolvaz ailesinin üyeleri olan invertazlardır. Siteye özgü inversiyonlar için rekombinasyon arttırıcılar. E. coli Fis proteini. İnvertazoma. Resolvazlar tarafından gerçekleştirilen rekombinasyonun moleküler modeli. Gen ifadesinin düzenlenmesinde bölgeye özgü inversiyonların rolü.

Mobil genetik elemanların transpozisyonları. Prokaryotlarda transpozisyonlar. Mobil genetik elementler: IS elementleri, transpozonlar (Tn), Mu faj. Hareketli elemanların yapısı. Çeşitli hareketli elemanlar tarafından kontrol edilen işlevler. Transpozaz. Konakçı hücre proteinlerinin transpozisyona katılımı. Mobil elemanın hedef DNA'ya entegrasyonunun özgüllüğü sorunu. Aktarım süreçlerini oluşturan reaksiyonların ortaklığı farklı türler Prokaryot ve ökaryotların hareketli elemanları.

Tn3 ailesinin basit transpozonlarının genetik organizasyonu. Genler tnpA ve tnpR, bunların ürünleri. Replikatif aktarım, sürecin iki aşaması. Shapiro'nun moleküler modeli. Kompleks transpozonlar Tn5, Tn9 ve Tn10'da replikatif olmayan transpozisyonun genetik kontrolü ve moleküler mekanizması. Mu fajında ​​genetik kontrol ve transpozisyon mekanizmaları. Transpozozom.

Gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin konjugatif transpozonları, sınıflandırılmaları. Genetik kontrol ve aktarım mekanizmaları. Biyolojik önemi.

Ökaryotların hareketli genetik elemanları (maya, bitkiler, Drosophila, memeliler). Ökaryotik hareketli elementlerin sınıflandırılması. Prokaryotik tipte yapıya sahip elementler. Maya, bitki ve hayvanlarda tip I retrotranspozonlar, yapıları, genetik kontrolü ve transpozisyon mekanizmaları, sınıflandırılması. Tip II retrotranspozonlar: yapısal özellikler, dağılım, aktarım mekanizması.

Prokaryot ve ökaryotlarda yer değiştirebilen elementlerin neden olduğu genetik etkiler: gen ifadesindeki değişiklikler, gen mutasyonları, kromozomal yeniden düzenlemeler, hibrit disgenezi. Mobil elemanların kromozom yapısının organizasyonuna katılımı. Canlı organizmaların intogenezinde ve genetik materyalin evrimindeki rol. Genetik araştırma için bir araç olarak mobil unsurlar.

Yasadışı rekombinasyon. Yasadışı rekombinasyona atfedilen olayların kapsamı. DNA giraz tarafından katalize edilen bakterilerde homolog olmayan rekombinasyon. Moleküler model (Ikeda). Omurgalılarda DNA'ya bağımlı protein kinazı içeren homolog olmayan rekombinasyon. Çift sarmal kırılmalarının onarımında, ekzojen DNA'nın kromozomlara entegrasyonunda ve immünoglobulin DNA dizilerinin yeniden düzenlenmesinde rol.

Ontogenezde genetik materyalin programlanmış rekombinasyon yeniden düzenlemeleri

Bacillus subtilis'te sporülasyon sırasında ve filamentli siyanobakterilerde heterosistlerin oluşumu sırasında bölgeye özgü rekombinasyon kullanılarak bağlantısız gen parçalarının birleştirilmesi. Siliyer siliatlarda makronükleus oluşumu sırasında genetik materyalin yeniden düzenlenmesi. Bazı omurgasız temsilcilerinde kromatin azalması.

İmmünoglobulin DNA dizilerinin yeniden düzenlenmesinde yer alan omurgalılarda bölgeye özgü rekombinasyon. İmmünoglobulin moleküllerinin yapısı. İmmünoglobulinleri kodlayan genlerin oluşumunda rol oynayan DNA dizilerinin organizasyonu ve yapısı. RAG1 ve RAG2 gen ürünlerinin rolü. İmmünoglobulin genlerinin kodlayıcı bölümlerinin birleştirilmesi sırasında bölgeye özgü rekombinasyon mekanizması. İmmünoglobulin genlerinin oluşumuna diğer genetik süreçlerin katılımı: homolog rekombinasyon (ektopik mitotik geçiş, ektopik mitotik dönüşüm), yasadışı rekombinasyon, hipermutajenez, alternatif birleştirme. Bu süreçlerin B lenfosit farklılaşmasının belirli aşamalarıyla ilişkisi.

Dönüşüm, serbest bir DNA molekülünün bir organizmanın hücresi tarafından çevreden emilmesi ve genoma entegrasyonu sürecidir; bu, böyle bir hücrede, DNA donör organizmasının yeni kalıtsal özelliklerinin ortaya çıkmasına yol açar. Bazen dönüşüm, transdüksiyon, konjugasyon vb. dahil olmak üzere herhangi bir yatay gen transferi süreci olarak anlaşılır.

Prokaryotların dönüşümü

Herhangi bir popülasyonda bakterilerin yalnızca bir kısmı çevreden DNA moleküllerini emebilir. Hücrelerin bunun mümkün olduğu duruma yeterlilik durumu denir. Tipik olarak, logaritmik büyüme fazının sonunda maksimum sayıda yetkin hücre gözlenir.

Yeterlilik durumunda bakteriler, otolizin, endonükleaz I ve DNA bağlayıcı proteinin sentezini aktive eden özel bir düşük moleküler protein (yeterlilik faktörü) üretir. Otolisin, DNA'nın içinden geçmesine izin veren hücre duvarını kısmen yok eder ve ayrıca bakterilerin ozmotik şoka karşı direncini azaltır. Yeterlilik durumunda genel metabolizma hızı da azalır. Hücreleri yapay olarak yetkin duruma getirmek mümkündür. Bunu yapmak için, yüksek miktarda kalsiyum, sezyum, rubidyum iyonları, elektroporasyon içeren ortamlar kullanın veya alıcı hücreleri hücre duvarı olmayan protoplastlarla değiştirin.

Dönüşümün etkinliği, hücrelere 1 μg süper sarmallı plazmid DNA eklendikten ve hücrelerin bir besin ortamına ekilmesinden sonra bir Petri kabı üzerinde büyüyen kolonilerin sayısı ile belirlenir. Modern yöntemler Verimliliğe ulaşmaya izin verin 106-109.

Emilen DNA çift sarmallı olmalıdır (tek sarmallı DNA'nın dönüşümünün verimliliği çok daha düşüktür, ancak zamanla biraz artar). asidik ortam), uzunluğu en az 450 baz çiftidir. İşlem için optimal pH yaklaşık 7'dir. Bazı bakteriler için (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus), emilen DNA'nın belirli diziler içermesi gerekir.

DNA, DNA bağlayıcı proteine ​​geri dönüşümsüz bir şekilde adsorbe edilir, ardından iplikçiklerden biri endonükleaz tarafından 2-4 bin baz çifti uzunluğunda parçalara bölünür ve hücreye nüfuz eder, ikincisi tamamen yok edilir. Bu parçaların olması durumunda yüksek derece Bakteri kromozomunun herhangi bir bölümüyle homoloji varsa, bu bölümlerin bunlarla değiştirilmesi mümkündür. Bu nedenle dönüşümün verimliliği, verici ile alıcı arasındaki evrimsel mesafeye bağlıdır. Toplam işlem süresi birkaç dakikayı geçmez. Daha sonra, bölünme sırasında, orijinal DNA ipliği temelinde inşa edilen DNA, bir yavru hücreye girer ve yabancı bir parçayı (bölünme) içeren bir iplik temelinde oluşturulan DNA, başka bir yavru hücreye girer.

Sentetik polimer katyonları kullanılarak ökaryotik hücrelerin dönüşümü

Yabancı nükleik asitlerin sağlam hücrelere verilmesi veya Dönüşüm, birçok genetik mühendisliği yönteminin temelini oluşturur. Fonksiyonel genlerin dokulara taşınması, olası düzeltme Ciddi kalıtsal patolojilere yol açan gen eksikliği ve mutasyonlar veya kanserli tümörler. Şu anda, DNA'nın hücrelere yerleştirilmesi için bir dizi teknik geliştirilmiştir; bunların arasında en yaygın olanları kalsiyum fosfat veya dietilaminoetil-dekstran (DEAE-dekstran) ile çökeltme, elektroporasyon, mikroenjeksiyon, DNA'nın yeniden yapılandırılmış bir viral kabuk veya lipozomlara (yapay) yerleştirilmesidir. membran lipit kesecikleri).

Bu yöntemlerin çeşitliliğine rağmen, pro- ve ökaryotik hücreleri dönüştürmenin yeni yollarının araştırılması devam etmektedir. Bu bir yandan dönüşümün verimliliğini artırma ihtiyacından kaynaklanmaktadır; diğer yandan yukarıda sıralanan yöntemler yalnızca sınırlı sayıda hücre hattına uygulanabilir ve RNA'nın hücrelere sokulması girişiminde etkisizdir. Son olarak, bu yaklaşımların çoğu kullanılamaz. genetik dönüşüm in vivo.

DNA taşıyıcıları olarak retroviral vektörler, DNA içeren virüslere ve HIV'e dayalı vektörler, katyonik lipitlere dayalı lipozomlar ve polimerik DNA bağlayıcı katyonlar kullanılır. Sentetik polimerlerin DNA taşıyıcıları olarak kullanılmasının bir dizi avantajı vardır: saklama ve saflaştırma kolaylığı, toksisite ve güvenlik testlerinin kolaylığı ve özellikle gen terapisi için önemli olan patojenik ve immünolojik komplikasyon riskinin azalması.

Doğrusal polikatyonlar ve DNA çözeltileri karıştırıldığında, zincirler arası elektrostatik bağların ortak bir sisteminin oluşması nedeniyle interpolielektrolit kompleksleri (IPEC'ler) oluşur. Bu durumda polikatyonik zincirler, polimerin türüne bağlı olarak küreler veya toroidler oluşturarak DNA molekülünü çevreler. IPEC'e dahil olmak DNA'nın sıkışmasına yol açar, nükleazların etkisine karşı direncini arttırır ve DNA ile etkileşimini arttırır. hücre zarı ve hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelere ilişkin olarak dönüştürme aktivitesinin arttırılması. Polikatyon moleküllerini, hücre zarına spesifik bağlanma yeteneğine sahip ligandlarla birleştirerek, IPEC'in reseptör yolu yoluyla hücreye nüfuz etmesini ve vücutta hedef hücrelere hedeflenen dağıtımını sağlamak mümkündür.

Gen terapisinde kullanılacak DNA dağıtım sistemleri, DNA'nın istenen organa, dokuya veya spesifik hücre grubuna ve ardından hücre çekirdeğine nüfuz etmesini sağlamalıdır. Gen terapisinde en sık kullanılan antisens oligonükleotidlerin, yönlendirildikleri mRNA'yı veya kromozomal DNA bölgesini bulması gerekir. Eklenen gen, onu ifade edebilen bir yapının parçası olmalıdır.

Ancak bu oldukça karmaşık bir sorundur. Bir nükleik asit veya oligonükleotid vücuda verildiğinde ağırlıklı olarak istenilen doku veya organa ulaşamayacak ve doğru yere ulaşan kısmı hidrofobik hücre zarından ancak çok az miktarda geçebilecektir. Ayrıca evrim sırasında vücut hücrelerini yabancı DNA dahil çevresel faktörlerin istilasından koruyacak mekanizmalar geliştirildi. Yabancı DNA hücre içine girdiğinde ihtiyaç duyulan yere yerleşemeyebilir ve dahası lizozomlara giderek burada nükleazlar tarafından yok edilebilir.

IPEC'in hücreye nüfuz etmesi ve hücre içi taşınması, muhtemelen endozomların oluşumu ve sıralı yıkımı nedeniyle meydana gelir. Bu sürecin her aşamasında malzemenin önemli bir kısmı kaybolur. Vektörlerin endozomlardan sitoplazmaya yetersiz salınımı ve bunların çekirdeğe etkisiz taşınması, transgen ekspresyonunun düşük verimliliğine yol açar.

Plazmid pBR 322'nin kısıtlama haritası:

sayılar nükleotidlerin numaralandırmasını gösterir;

ince çizgiler - kısıtlama enzimleri tarafından tanınan tek alanlar;

üstte kalın gri oklar - transkripsiyon yönü;

Pbla - Ampr gen promotörü - ampisiline direnç;

Ptet - Tetr gen promoteri - tetrasiklin direnci;

TT1 - Rho'dan bağımsız transkripsiyon sonlandırıcı (pozisyon 3140-3160); TT2 - konum 3080-3110; ROP, RNA 1 ve RNA 2 (kopya sayısının negatif düzenleyicisi) arasında dubleks oluşumunu destekleyen bir proteindir; RNA 1 - kontrol RNA (plazmidin kopya numarasını kontrol eder); RNA 2 - “primer” RNA (kopyalama için bir primer görevi görür); kalın siyah oklar - RNA 1 ve RNA 2'nin transkripsiyon yönü

M13 fajına dayalı vektörler

DNA transferinin etkinliğini arttırmanın üç yolu vardır. ökaryotik hücreler sentetik polikatyonların kullanılması. İlk olarak, bir polikatyon molekülüne bağlanan ligandlar nedeniyle transfeksiyonun özgüllüğünü arttırır ve komplekslerin belirli bir fenotipteki hücrelerle seçici etkileşimini sağlar. İkincisi, hücreye eklenen genlerin veya oligonükleotitlerin seçimi nedeniyle dönüşümün etkinliğinin arttırılması. Üçüncüsü, hücre zarıyla daha etkili etkileşime giren ligandların ve zarın dengesini bozan maddelerin kullanılmasıyla elde edilen transfeksiyon sıklığındaki artış. Ayrıca yeni polikatyonların sentezi de mümkündür.

St. Petersburg'daki Rusya Tıp Bilimleri Akademisi Grip Araştırma Enstitüsü Moleküler Viroloji ve Genetik Mühendisliği Laboratuvarı, DNA ve viral parçacıkları hücrelere aktarmanın yollarını araştırıyor. Bu çalışma, Rusya Bilimler Akademisi Makromoleküler Bileşikler Enstitüsü çalışanları tarafından sentezlenen bir dizi polimer desteği kullanıyor. Ekspresyon vektörleri olarak aşağıdaki plazmidler kullanıldı: sitomegalovirüs promoterini ve b-galaktosidaz genini içeren pUC 18 ve sitomegalovirüs promoterini ve alg yeşili floresan protein genini içeren pBR 322.

Yapılan çalışmalar sonucunda düşük molekül ağırlıklı poli-(2-(dimetilamino)etil) metakrilatın (PDMAEMA) IPEC'lerinin en yüksek transfeksiyon aktivitesine sahip olduğu tespit edildi. Daha fazla araştırma, çözüme yönelik yeni yaklaşımlar geliştirmemize olanak tanıyacak mevcut sorunlar virolojide, moleküler ve hücre biyolojisi, genetik mühendisliği, gen terapisi.

Transdüksiyon (Latince transductio - hareketten), bakteriyel DNA'nın bir bakteriyofaj tarafından bir hücreden diğerine aktarılması işlemidir. Bakteri genetiğinde genom haritalaması ve suş mühendisliği için genel transdüksiyon kullanılır. Hem ılıman fajlar hem de öldürücü olanlar transdüksiyon yeteneğine sahiptir; ancak ikincisi bakteri popülasyonunu yok eder, bu nedenle onların yardımıyla transdüksiyonun ne doğada ne de araştırmada büyük önemi yoktur.

Genel (spesifik olmayan) transdüksiyon

Bakteri hücresinde plazmid formunda bulunan P1 fajı ve bakteri kromozomunun herhangi bir kısmına entegre olan P22 ve Mu fajları tarafından gerçekleştirilir. Profaj indüksiyonundan sonra hücre başına 10?5 olasılıkla bakteriyel bir DNA fragmanının faj kapsidine hatalı paketlenmesi mümkündür, bu durumda faj DNA'sı yoktur; Bu parçanın uzunluğu normal faj DNA'sının uzunluğuna eşittir, kökeni herhangi bir şey olabilir: kromozomun rastgele bir parçası, bir plazmid veya diğer ılıman fajlar.

Başka bir bakteri hücresine girdikten sonra, genellikle homolog rekombinasyon yoluyla DNA'nın bir parçası genomuna dahil edilebilir. Faj tarafından aktarılan plazmitler bir halkaya kapanabilir ve yeni bir hücrede çoğalabilir. Bazı durumlarda, bir DNA fragmanı alıcı kromozomuna entegre edilmez ve kopyalanmaz, hücrede depolanır ve kopyalanır. Bu olaya abortif transdüksiyon denir.

Spesifik transdüksiyon

Spesifik transdüksiyon en iyi şekilde faj L örneği kullanılarak incelenmiştir. Bu faj, E. coli kromozomunun yalnızca bir bölgesine (att-bölgesine) spesifik bir nükleotid dizisiyle (faj DNA'sındaki att-bölgesine homolog) entegre edilmiştir. İndüksiyon sırasında, bunun dışlanması bir hatayla gerçekleşebilir (hücre başına olasılık 10?3-10?5): faj DNA'sı ile aynı boyutta bir parça kesilir, ancak başlangıcı yanlış yerdedir. Bu durumda fajın bazı genleri kaybolur, bazı E. coli genleri ise onun tarafından yakalanır. Bu durumda gen aktarımı olasılığı, att bölgesine olan mesafe arttıkça azalır.

Kromozoma spesifik olarak entegre edilen her bir ılıman faj, kendi att bölgesi ve buna bağlı olarak yanında yer alan ve iletebildiği genler ile karakterize edilir. Bir dizi faj, kromozomun herhangi bir yerine entegre olabilir ve belirli bir transdüksiyon mekanizması yoluyla herhangi bir geni aktarabilir. Ek olarak kromozom genellikle faj DNA'sının att bölgesine kısmen homolog olan diziler içerir. Tamamen homolog bir att bölgesi hasar görürse, fajın bu diziler boyunca kromozoma dahil edilmesini ve spesifik transdüksiyon sırasında onlara bitişik genlerin transferini sağlamak mümkündür.

Bakteriyel genleri taşıyan ılıman bir faj, yeni bir konakçı bakterinin kromozomuna entegre edildiğinde, halihazırda iki özdeş gen içerir - kendisinin ve dışarıdan getirilenler. Faj kendi genlerinin bir kısmına sahip olmadığından çoğu zaman uyarılamaz ve çoğalamaz. Ancak aynı hücre aynı türden bir "yardımcı" fajla enfekte olduğunda, kusurlu bir fajın indüksiyonu mümkün hale gelir. Hem normal "yardımcı" fajın DNA'sı hem de kusurlu fajın DNA'sı kromozomdan çıkar ve taşıdığı bakteri genleriyle birlikte çoğalır. Bu nedenle ortaya çıkan faj parçacıklarının yaklaşık %50'si bakteriyel DNA taşır. Bu olaya yüksek frekanslı transdüksiyon (HFT) denir.

Konjugasyon (Latince conjugatio'dan - bağlantı), paraseksüel süreç - iki bakteri hücresinin doğrudan teması yoluyla genetik materyalin bir kısmının (plazmitler, bakteri kromozomu) tek yönlü transferi. 1946 yılında J. Lederberg ve E. Taitem tarafından keşfedilmiştir. Sahip olmak büyük değer Doğada, gerçek bir cinsel sürecin yokluğunda yararlı özelliklerin değişimini teşvik ettiği için. Tüm yatay gen transferi süreçleri arasında konjugasyon, en fazla miktarda genetik bilginin transferine olanak sağlar.

Mekanizma

İki hücre arasında başarılı bir şekilde temas kurmak için donör hücresinde konjugatif (cinsiyet, bulaşıcı) bir plazmidin mevcut olması gerekir. Bunlardan ilki F-plazmidinin keşfiydi: yaklaşık 100 bin baz çifti uzunluğunda bir epizom (bakteri kromozomuna entegre olabilen). Plazmid, bir dizi fonksiyonu kodlayan genleri taşır. Bunlardan biri alıcı hücreye yapışmadan sorumlu olan sex pili'nin oluşumudur.

Konjugatif plazmitler ayrıca diğer bakterilerin pililerinin belirli bir bakterinin hücre duvarına bağlanmasını önleyen proteinleri de kodlar. Bu nedenle, halihazırda aktarılabilir plazmidler içeren hücrelerin, konjugasyon için alıcı olarak hareket etme olasılıkları birkaç kat daha düşüktür.

Plazmid, DNA'sının iplikçiklerinden birini belirli bir noktada (oriT) kesen bir endonükleazı kodlar. Daha sonra kesilen iplik açılır ve 5 inçlik uç alıcı hücreye aktarılır. DNA'nın cinsiyet pilisindeki kanallar aracılığıyla aktarıldığı ileri sürülmüştür ancak şimdi aktarımın hücre duvarındaki gözenekler aracılığıyla gerçekleştiği gösterilmiştir. Alıcı hücreye giren ipliğin ilk segmenti Anti-kısıtlama genleri DNA'da bulunur. Bu genlerin, kısıtlama enzimleri tarafından DNA yıkımı sürecini bloke eden proteinlerin birikmesini sağlamak için oraya vardıktan hemen sonra alıcıya kopyalanması gerekir. aktarılan zincir bir halka halinde kapatılır ve plazmid DNA'nın çift sarmallı yapısı birkaç dakika içinde yenilenir.

Konjugatif plazmit, IS elemanlarını içeren homolog rekombinasyon yoluyla kromozoma entegre edilebilir. Konjugasyon da aynı mekanizmayı takip eder ancak alıcıya yalnızca plazmit değil, aynı zamanda donörün kromozomal materyali de aktarılır. Bu durumda süreç saatlerce sürüyor ve aktarılan DNA zinciri sıklıkla kopuyor. DNA transferini yapay olarak durdurarak farklı zamanlar ve hangi genlerin aktarıldığı gözlemlenerek E. coli kromozomunun haritası çıkarıldı ve halka yapısı gösterildi.

Bir kromozomdan ayrıldığında, plazmit onun parçasını yakalayabilir ve kendisiyle birlikte başka bir hücreye aktarabilir (transdüksiyona benzer). Bu sürece seksdüksiyon denir.

Mobilize edilebilir plazmitler olarak adlandırılan bazı küçük plazmitler, "yardımcı" aktarılabilir plazmid transfer aparatı kullanılarak konjugasyon sırasında transfer edilebilir. Bunu yapmak için konjugatif plazmidin oriT'sine benzer diziler içermeleri ve endonükleazları tarafından tanınmaları gerekir.

Bakterilerde rekombinasyon: transformasyon, transdüksiyon, konjugasyon.

Parametre adı	Anlam
Makale konusu:	Bakterilerde rekombinasyon: transformasyon, transdüksiyon, konjugasyon.
Puan anahtarı (tematik kategori)	Kültür

Bakterilerde rekombinasyon (genetik materyal değişimi)rekombinasyonlardan farklı enökaryotlar:

‣‣‣ bakteriler var çeşitli rekombinasyon mekanizmaları;

‣‣‣ bakterilerde rekombinasyon sırasında ökaryotlarda olduğu gibi bir zigot oluşmaz, fakat merozigot(alıcının tüm genetik bilgisini ve donörün genetik bilgisinin bir kısmını ekleme şeklinde taşır);

‣‣‣ rekombinant bakteri hücresinde sadece kalite değişmekle kalmaz, aynı zamanda genetik bilgi miktarı.

Dönüşüm- Bu bitmiş bir DNA preparatının alıcı bakteri hücresine sokulması yoluyla bakterilerde genetik bilgi alışverişi(özel olarak hazırlanmış veya donör hücresinden doğrudan izole edilmiş). Çoğunlukla genetik bilginin aktarımı, alıcının donör DNA'sı içeren bir besin ortamı üzerinde yetiştirilmesiyle gerçekleşir. Dönüşüm sırasında donör DNA'sının algılanması için alıcı hücrenin belirli bir fizyolojik durumda olması gerekir. (yeterlilik),ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ bakteri popülasyonunun özel işlenmesi yöntemleriyle elde edilir.

Dönüşüm sırasında tek (genellikle 1) karakteristik iletilir. Transformasyon, alıcı hücreye saf bir DNA preparatı verildiğinden, DNA'nın veya parçalarının belirli bir fenotipik özellik ile bağlantısının en nesnel kanıtıdır.

İletim- Ilıman (dönüştürücü) bakteriyofajlar kullanılarak donörden alıcıya aktarılarak bakterilerdeki genetik bilginin değişimi.

Transdüksiyon fajları 1 veya daha fazla gen (özellik) aktarabilir.

İletim gerçekleşir:

‣‣‣ spesifik - her zaman aynı gen aktarılır;

‣‣‣ spesifik olmayan - farklı genler aktarılır.

ilgili donör genomunda transdüksiyon fajlarının lokalizasyonu ile:

‣‣‣ spesifik transdüksiyon durumunda bunlar her zaman kromozom üzerinde tek bir yerde bulunur;

‣‣‣ spesifik olmayan yerelleştirme ile tutarsızdır.

Konjugasyon- bakterilerdeki genetik bilginin, doğrudan temas sırasında donörden alıcıya aktarılarak aktarılması. Donör ile alıcı arasında bir konjugasyon köprüsü oluştuktan sonra, donör DNA'sının bir ipliği alıcı hücreye bunun üzerinden girer. Temas ne kadar uzun olursa, alıcıya o kadar fazla donör DNA'sının aktarılması gerekir.

Konjugasyonun belirli aralıklarla kesintiye uğramasına dayanarak bakteri kromozomu yapısındaki genlerin sırasını belirlemek mümkündür. bakterilerin kromozom haritaları (üretmek bakterilerin haritalandırılması).

F+ hücrelerinin donör işlevi vardır.

Bakterilerde rekombinasyon: transformasyon, transdüksiyon, konjugasyon. - kavram ve türleri. "Bakterilerde rekombinasyon: dönüşüm, transdüksiyon, konjugasyon" kategorisinin sınıflandırılması ve özellikleri. 2017, 2018.

Prokaryotlar eşeyli üremezler . İçlerindeki rekombinasyon, kromozom içindeki genlerin lokalizasyonunun değiştirilmesinden veya donörün DNA'sının bir kısmının alıcı hücreye nüfuz etmesinden oluşan intragenomik yeniden düzenlemelerin bir sonucu olarak ortaya çıkar.

Rekombinasyonların bir sonucu olarak, genotipi esas olarak alıcının genotipi ile donörün bir DNA fragmanının dahil olduğu temsil edilen yalnızca bir rekombinant oluşur.

Genetik rekombinasyonlar, bireysel genler veya bağlantılı gen grupları içindeki bir dizi enzimin katılımıyla meydana gelir. Bakterilerin rekombinasyon yeteneğini belirleyen özel genler vardır. Genetik materyalin (kromozomal genler) bir bakteriden diğerine transferi transformasyon, transdüksiyon ve konjugasyon yoluyla gerçekleşir. Plazmit genlerinin aktarımı - transdüksiyon ve konjugasyon yoluyla.

Dönüşüm - aktif bir prensibin etkisi altında bir hücre tipinde başka bir hücre tipine göre değişiklik. Bu fenomen Griffith tarafından Streptococcus pneumoniae'de (1928) keşfedildi; Daha sonra Avery, McLeod ve McCarthy (1944), pnömokokların DNA molekülü formundaki dönüşüm prensibini izole ettiler. Bu, DNA'nın genetik bilginin taşıyıcısı olduğuna dair ilk doğrudan kanıttı.

Ölü bakteriler sürekli olarak diğer bakteriler tarafından alınabilecek DNA'yı serbest bırakır. Geleneksel olarak bakteri hücresine giren herhangi bir yabancı DNA, endonükleazlar tarafından parçalanır. Belirli koşullar altında bu DNA bakteri genomuna entegre olur ve onu değiştirir. Plazmid DNA'nın eklenmesi bakterilerin virülansını değiştirebilir. Dönüşüm, genetik bilgi alışverişinde küçük bir rol oynar.

İletim - bir DNA fragmanının bir bakteriyofaj kullanılarak bir hücreden (vericiden) diğerine (alıcıya) aktarılması. Bu fenomen Lederberg ve Zinder (1952) tarafından keşfedildi. 3 tür iletim vardır:

spesifik olmayan (genel) - bakteriyofaj ile enfekte olmuş bir hücrede, yavru popülasyonun toplanması sırasında, herhangi bir bakteriyel DNA veya plazmit parçası, viral DNA ile birlikte bazı fajların kafalarına nüfuz edebilir.

Bu durumda faj genomunun bir kısmını kaybeder, kusurlu hale gelir ve transdüksiyona neden olabilir. Bu transdüksiyon şekliyle hemen hemen her gen alıcı hücrelere aktarılabilir. Bir fajın belirli genleri bir donör bakteriden alıcı bir bakteriye aktarma yeteneği ile karakterize edilir.

Bunun nedeni, dönüştürücü bir bakteriyofajın oluşumunun, profajın, profajın yanındaki donör hücresindeki kromozom üzerinde bulunan genlerle birlikte bakteri kromozomundan bölünmesiyle meydana gelmesidir. Dönüştürücü fajlar, alıcı suşun hücreleriyle etkileşime girdiğinde, donör bakterinin geni, kusurlu fajın DNA'sı ile birlikte alıcı bakterinin kromozomuna dahil edilir. Kusurlu bir faj tarafından lizojenize edilen bakteriler, tüm lizojenik hücreler gibi, homolog virülan bir faj tarafından daha sonra enfeksiyona karşı bağışıktır. sonuçsuz.

Konjugasyon Fajın getirdiği donör bakterinin DNA fragmanı, alıcı bakterinin kromozomunda yer almaz, sitoplazmasında bulunur ve bu şekilde görev yapabilir. Bir bakteri hücresinin bölünmesi sırasında, transdüksiyona uğramış bir donör DNA fragmanı iki kardeş hücreden yalnızca birine aktarılabilir, yani tek hatlı olarak kalıtsal olarak aktarılabilir ve yavaş yavaş kaybolabilir.

- çaprazlandıklarında genetik materyalin donör hücresinden alıcı hücreye aktarılması. Bakterilerdeki konjugasyon süreci ilk olarak 1946'da D. Lederberg ve E. Tatum tarafından keşfedildi. Daha sonra genetik materyalin donörlerinin F-plazmidini (cinsiyet faktörü) taşıyan hücreler olduğu ortaya çıktı. Bir F + ile bir F "hücresini geçerken, plazmid özerk bir durumdaysa, donör kromozomundan bağımsız olarak cinsiyet faktörü iletilir. Bu durumda, hemen hemen tüm alıcı hücreler F plazmidini alır ve F + hücreleri haline gelir.

Konjugasyon adımları:

bir donör hücresinin bir alıcı hücreye seks villi (sex pili) kullanılarak bağlanması.

Donör bakterisinin sitoplazmasında özerk bir durumda bulunan F-faktörü ve diğer plazmidlerin donör hücresinden alıcı hücreye aktarılabildiği bir konjugasyon köprüsü oluşturulur.

F-plazmidinin bakteri kromozomuna entegrasyonu, DNA iplikçiklerinden birinde bir kırılmaya yol açar ve bu da onun alıcı hücreye aktarılmasını mümkün kılar.

Bir transdüksiyon deneyi kurma

Steril bir test tüpüne 1 ml hacimde E.coli kültüründen süzülerek elde edilen ılıman faj eklenir, ardından laktozu parçalayamayan E.coli'nin 1 ml et suyu kültürü ilave edilir. bu tüp. Test tüpü 40 dakika boyunca termostatta tutulur. Daha sonra plakanın Endo ortamına sahip bölümleri aşılanır: ılıman faj; E. coli lac-; deneysel bir test tüpünden.

1 ml'lik bir hacimdeki donör et suyu kültürü ve alıcı et suyu kültürü, ayrı bir steril tüpe eklenir. Test tüpü 40 dakika boyunca termostatta tutulur. Daha sonra donör ve alıcı kültürleri ve donör-alıcı karışımı, minimum besin ortamının ayrı sektörlerine ekilir. 37°C'de 24 saat inkübe edin.