Ферменты - биологические катализаторы, высокомолекулярные вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой. Они строго специфичны и играют важнейшую роль в обмене веществ микроорганизмов. Специфичность их связана с активными центрами, образуемыми группой аминокислот, т. е. каждый фермент реагирует с определенным химическим соединением или катализирует одну или несколько близких химических реакций. Например: фермент лактаза расщепляет лактозу, мальтаза - мальтозу и т. д.

Экзоферменты - выделяясь во внешнюю ере- Эндоферменты - участ-ду, расщепляют макромолекулы питательных Вуют в реакциях обмена веществ до более простых соединений, которые могут быть усвоены микробной клеткой (экзоферменты гидролиза вызывают гидролиз жиров, белков, углеводов).

Ферментный состав микроорганизмов является постоянным, а различные виды микробов четко различаются по набору ферментов. Поэтому изучение ферментативного состава имеет важное значение для идентификации различных микроорганизмов.

Практическое использование ферментативных свойств микробов: процессы брожения, грибы в пивоварении и виноделии, обработка шкур, для смягчения; консервирование. Приготовление биодобавок к стиральным порошкам, для удаления белковых загрязнений, так как они расщепляют белки до водорастворимых.

С помощью ферментов получают витамины, гормоны, алкалозы.

веществ, происходящих внутри клетки.

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

В жизнедеятельности бактерий ферменты играют важную роль, так как являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения.

Устойчивость ферментативных систем бактерий позволяет использовать их биохимические свойства в сочетании с морфологическими и культуральными признаками для определения видов микроорганизмов.

Для обнаружения ферментов используют только чистые культуры микроорганизмов, которые засевают на специальные дифференциально-диагностические среды. Преимущественное значение при исследовании биохимической активности бактерий имеют сахаролитические, протеолитические и окислительно-восстановительные ферменты.

Сахаролитические ферменты микробов. Сахаролитическая активность микроорганизмов определяется по ферментативному расщеплению многоатомных спиртов и углеводов при посеве их на дифференциально-диагностические среды. Различные виды микробов при оптимальных условиях по-разному относятся к одним и тем же сахарам, расщепляя одни и оставаясь нейтральными по отношению к другим. Этосвойство микробов используется в бактериологической практике для дифференциации различных видов и разновидностей бактерий.

На плотных, жидких и полужидких питательных средах, содержащих различные индикаторы (чаще всего индикатор Андреде), сахара под действием сахаролитических ферментов бактерий расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и водород. Накопление кислот снижает рН питательной среды, что приводит к изменению цвета индикатора и самой среды. Если бактерии не выделяют фермент к данному углеводу, то цвет индикатора и питательной среды не меняется. Поэтому набор питательных сред с индикаторами называют пестрым или цветным рядом.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий чаще всего засевают в цветные среды («пестрый ряд») Гисса (рец. 15) с углеводами и индикатором Андреде (рец. 16) или индикатором ВР (смесь водного голубого с розоловой кислотой). «Пестрый ряд» Гисса содержит обычно пять пробирок; с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. В некоторых случаях для более углубленного изучения биохимических свойств микроорганизмов «пестрый ряд» Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой. Сахара, применяемые для обнаружения сахаролитических ферментов, должны быть химически чистыми.

Среды Гисса бывают жидкие и полужидкие (с добавлением 0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими питательными средами опускают бродильную трубочку (поплавок), которая представляет собою стеклянную трубочку, запаянную с одного конца. При стерилизации поплавок полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют жидкость из поплавка с образованием воздушного колокола. В полужидких средах газообразование определяют по наличию пузырьков в толще среды.

Протеолитические ферменты микробов. Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, аминокислоты и полипептиды.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроорганизмов засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатину, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Для определения протеолитической активности микроорганизмов на желатине готовят мясо-пептонную желатину (рец. 17) и разливают в пробирки столбиком по 5-6 мл. После застывания питательной среды производят посев уколом, погружая петлю в глубь питательной среды до дна пробирки.

Микробы, способные расти при низкой температуре, инкубируют при 20°С-22°С. Остальные посевы инкубируют при 37°С. При температуре 37°С желатина плавится, поэтому после инкубации вынутые пробирки помещают в холодильник или холодную воду для застывания среды. После застывания среды приступают к просмотру результатов роста микроорганизмов. При выделении протеолитического фермента желатиназы происходит расщепление белков и наблюдается разжижение питательной среды, с рисунком, характерным для определенных видов микроорганизмов (рис. 37). Например, сибиреязвенная палочка разжижает желатину желатину в виде воронки, стафилококки — в виде чулка, синегнойная палочка — послойно и т.д.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Различные формы разжижения желатины микроорганизмами

Определение протеолитической активности микробов на молочном агаре Эйкмана. Готовят молочный агар Эйкмана, для чего к 10 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 3 мл обезжиренного молока и смешивают. Молочный агар Эйкмана (рец. 18) разливают в чашки Петри и после остывания засевают исследуемым микроорганизмом петлей штрихами или шпателем, чтобы получить изолированные колонии. Через 24-48 часов инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитические ферменты, разлагают молочный белок — казеин, в результате чего вокруг колоний образуются четкие прозрачные зоны на фоне мутной питательной среды.

Дата публикования: 2015-11-01; Прочитано: 1165 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.001 с)…

Лекция № 3. Химическая структура, биохимические свойства и ферменты бактерий.

Клетка — универсальная единица живой материи. По химическому составу существенных отличий прокариотических и эукариотических клеток нет.

Химические элементы, входящие в состав живой материи, можно разделить на три основные группы.

1.Биогенные химические элементы (С, О, N, H). На их долю приходится 95% сухого остатка, в т.ч. 50%- C, 20%- O, 15%- N, 10%- H).

2.Макроэлементы — P, S,Cl, K, Mg, Ca, Na. На них приходится около 5 %.

3.Микроэлементы- Fe, Cu, I, Co, Mo и др. На них приходятся доли процента, однако они имеют важное значение в обменных процессах.

Химические элементы входят в состав различных веществ — воды, белков, липидов, нейтральных жиров, углеводов, нуклеиновых кислот. Синтез соединений контролируется генами. Многие вещества бактериальная клетка может получать извне — из окружающей среды или организма хозяина.

Вода составляет от 70 до 90 % биомассы. Содержание воды больше у капсульных бактерий, меньше всего- в спорах.

Белки встречаются во всех структурных элементах клетки. Белки могут быть более простые (протеины) и сложные (протеиды), в чистом виде или в комплексе с липидами, сахарами. Выделяют структурные (структурообразующие) и функциональные (регуляторные) белки, к последним относятся ферменты.

В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные- диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота , с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина , обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок — пилин .

Пептидную природы имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А — специфический белок S.aureus — фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М — специфический белок гемолитических стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение.

Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3 — 4 мажорных (основных) и более 10- второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков- порины , образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы.

Белки входят в состав пептидогликана — биополимера, составляющего основу бактериальной клеточной стенки. Он состоит из остова (чередующиеся молекулы двух аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочек — боковых и поперечных. Наличие двух типов связей — гликозидных (между аминосахарами) и пептидных, которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети . Пептидогликан- наиболее устойчивое соединение, которое образует ригидную мешковидную макромолекулу, определяющую постоянную форму бактерий и ряд их свойств .

1.Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты.

2.Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента.

3.Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов.

4.Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

5.Пептидогликан обладает противоопухолевым действием.

6.Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку.

Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды .

Удивительное таинство жизни — синтез белка осуществляется в рибосомах . Существует два основных типа рибосом — 70S (S- константа седиментации, единица Сведберга) и 80S. Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов. Антибиотики не действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов.

Липиды (главным образом форфолипиды) содержатся в цитоплазматической мембране (липидный бислой), в также в наружной мембране грамотрицательных бактерий. Есть микроорганизмы, содержащие большое количество липидов (до 40% сухого остатка)- микобактерии. В состав липидов входят различные жирные кислоты , весьма специфичные для разных групп микроорганизмов. Их определение имеет в ряде случаев диагностическое значение, например у анаэробов, микобактерий.

У микобактерий туберкулеза в составе липидов имеется ряд кислотоустойчивых жирных кислот- фтионовая, миколовая и др. Высокое содержание липидов и их состав определяют многие свойства микобактерий туберкулеза:

Устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам;

Трудная окрашиваемость красителями (используют специальные методы окраски, чаще- по Цилю- Нильсену);

Устойчивость возбудителя к солнечной радиации и дезосредствам;

— патогенность.

Тейхоевые кислоты встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий.

Представляют собой водорастворимые линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибола, связанные фосфодиэфирными связыми. С тейхоевыми кислотами связаны главные поверхностные антигены ряда грамположительных бактерий.

Углеводы встречаются чаще в виде полисахаридов , кторые могут быть экзо- и эндоклеточными. Среди экзоклеточных полисахаридов выделяют каркасные (входят в состав капсул) и истинно экзополисахариды (выходят во внешнюю среду). Среди бактериальных полисахаридов многие находят медицинское применение. Декстраны — полисахариды с большой молекулярной массой, по виду напоминают слизь. 6% раствор- кровезаменитель полиглюкин. Декстрановый гель сефадекс используется в колоночной хроматографии как молекулярное сито. Эндоклеточные полисахариды- запасные питательные вещества клетки (крахмал, гликоген и др.).

Липополисахарид (ЛПС) — один из основных компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий, это соединение липида с полисахаридом. ЛПС состоит из комплекса:

1.Липид А .

2.Одинаковое для всех грамотрицательных бактерий полисахаридное ядро.

3.Терминальная сахаридная цепочка (О- специфическая боковая цепь) .

Синонимы ЛПС- эндотоксин, О- антиген.

ЛПС выполняет две основные функции- определяет антигенную специфичность и является одним из основных факторов патогенности. Это- эндотоксин, токсические свойства которого проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток. Его токсичность определяется липидом А. ЛПС запускает синтез более 20 биологически активных веществ, определяющих патогенез эндотоксикоза, обладает пирогенным действием.

Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) находятся главным образом в рибосомах (р-РНК- 80- 85%), т(транспортные)- РНК- 10%, м(матричные)- РНК- 1- 2%, главным образом в одноцепочечной форме. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) может находиться в ядерном аппарате (хромосомная ДНК) или в цитоплазме в специализированных образованиях- плазмидах- плазмидная (внехромосомная) ДНК. Микроорганизмы отличаются по структуре нуклеиновых кислот, содержанию азотистых оснований . Генетический код состоит всего из четырех букв (оснований) — А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин). Наиболее часто для характеристики микроорганизмов используют как таксономический признак процентное соотношение Г/Ц, которое существенно отличается у различных групп микроорганизмов.

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты — специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов .

1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции.

2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов.

3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.

4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.

5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

6.Изомеразы — определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:

— конститутивные , синтез которых происходит постоянно;

— индуцибельные , синтез которых индуцируется наличием субстрата;

— репрессибельные , синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты . Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.

Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.

2.Протеолитические.

3.Аутолитические.

4.Окислительно- восстановительные.

5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.

Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).

Предыдущая12345678910111213141516Следующая

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

Ферменты бактерий. Ферментативная активность

Ферменты бактерий Ферменты являются высокоспецифичными биологическими катализаторами, без которых невозможны жизнь и размножение. Большое количество реакций, происходящих при жизни бактериальной клетки, указывает на существование у бактерий значительного количества ферментов. Ферменты - вещества белковой природы с большим молекулярным весом. Некоторые из них относятся к протеинам, другие являются сложными белками. Они построены из двух частей белка и небелковой части, называемой простетической группой. В состав ее могут входить витамины. нуклеотиды, атомы железа и пр. Связь между белковой частью фермента и го простетической группой может быть прочной и непрочной. При наличии непрочной связи в растворах наступает диссоциация фермента и при этом может освобождаться свободная простетическая группа.
Легко диссоциирующие иростетические группы ферментов называются коферментами. Обычно ферменты подразделяются на следующие основные группы:

1. Оксидоредуктазы. все ферменты, катализирующие окислительно восстановительные реакции.
2. Трансферазы. катализирующие перенос тех или иных групп (например аминогрупп, фосфатных остатков и т. д.
3.

Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Гидролазы, расщепляющие путем гидролиза Гт или иные соединения; к этому классу относятся также фосфатазы и дезампназы - ферменты, отщепляющие соответственно гидролитическим путем фосфат или аммонийные группы от различных органических соединений.
4. Лиазы, ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путем определенные группы (например, СОг, НгО, SH2 и т. д.).
5. Изомеразы, катализирующие внутримолекулярные перестройки в субстрате.
6. Лигазы (синтетазы) - класс ферментов, катализирующих присоединение друг к другу двух молекул с одновременным разрывом ппрофосфатной связи в трифосфатах (например, образующие С-О, С-N или С-S связи).

Наиболее высокой ферментативной активностью обладают сапрофиты; в меньшей степени это свойство выражено у патогенных бактерий. Изучение ферментов патогенных бактерий имеет исключительно важное значение, так как на основании определения ферментативной активности микробов можно дифференцировать различные виды и определять природу того или иного возбудителя заболеваний. Наряду с этим ферментативная активность микробов определяет патогенез и клиническую картину инфекционного заболевания.
Ферменты дифференцируют на экзо и эндоферменты. Экзоферменты выделяются клеткой во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции.
Ферменты бактерий подразделяются на конституитивные и индуцибельные. К первой группе относятся те ферменты, которые синтезируются бактериальной клеткой вне зависимости от того, на какой среде бактерия выращивается. Индуцибельные ферменты продуцируются данной бактерией лишь в ответ на действие специфического индуктора, присутствующего в среде.

В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам:оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых случаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Идентификация бактерий по ферментативной активности

Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3-5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2-6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный - при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетоин - промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода.

Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы:

1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1;

2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида.

О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 мин.

Для определения нитритов используют реактив Грисса: появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Ферментативные свойства бактерий

Для определения сахаролитических свойств из углеводов обычно используют лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит. Результат реакции определяется при помощи добавляемых в питательную среду различных индикаторов, дающих цветные реакции. Поэтому метод посева на дифференциально-диагностические среды получил название посева на пестрый ряд. Иногда, в так называемый длинный пестрый ряд, добавляют арабинозу, ксилозу, галактозу, инулин, крахмал и др.

При разложении углеводов происходит образование органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Кислоты вызывают изменение рН среды, что приводит к из-менению ее цвета в результате реакции индикатора. Образую-щийся газ вытесняет жидкость в верхней части поплавка (при ис-пользовании жидкого пестрого ряда) или вызывает разрыв агара (при применении полужидких сахаров).

Среды для определения сахаролитических свойств

Среды Гисса состоят из пептонной воды, 1% углевода и ин-дикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации запол-няется средой. При сбраживании сахара бактериями, цвет среды меняется на красный, а газ скапливается в поплавке.

Полужидкие сахара состоят из 0,7% мясопептонного агара, 1% сахара и индикатора рН (водно-голубая краска и розоловая кислота). Посев производится уколом. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, при наличии газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, сам агар разрывается. В ла-бораторной практике широко применяются и другие дифферен-циально-диагностические среды, в состав которых входят сахара.

Протеолитические свойства бактерий (расщепление белков) определяются обнаружениемконечных продуктов ферментации белков (индола, сероводорода, аммиака) и по способности раз-жижать желатину (мясопептонный бульон с 10-15% желатин).

Разжижать желатину способны микробы, выделяющие фер-мент типаколлагеназы. Процесс разжижения идет сверху, при-чем различные виды микробов дают характерную для них фор-му, потому это свойство также используется в целях идентифи-кации бактерий.

Определение ферментации белков по конечным продуктам распада проводится при посеве на мясопептонный бульон или пептонную воду.

Таким образом, завершая работу по выделению чистой культуры, мы имеем данные о морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойствах выделенных культур бактерий. Это дает основание приступить к видовой идентификации – основной задаче последнего этапа бактерио-логического исследования. Для этого используют определитель Берги. Это справочное издание, каталог бактерий. В нем все микроорганизмы сгруппированы по основным биологическим свойствам. Сопо-ставляя свойства выделенных культур с приведенными в опреде-лителе, устанавливают их принадлежность к группе, семейству, ро-ду и, наконец, виду.

По морфологии, типу дыхания, тинкториальным свойствам, способности к спорообразованию находят таксономическую группу для идентифицируемой культуры. По полным морфологическим, тинкториальным свойствам, типу дыхания, спорообразованию, культуральным свойствам и неко-торым биохимическим признакам находят семейство, по методо-логическим особенностям (наличие капсул, жгутиков и т.д.), культуральным и биохимическим признакам определяют род, а внут-ри рода по биохимическим и антигенным свойствам устанавли-вают вид.

Cамостоятельная работа студента

На практическом занятии

Контрольные вопросы

1. Питание бактерий: аутотрофы и гетеротрофы.

2. Классификация питательных сред.

3. Условия культивирования микробов.

4. Требования, предъявляемые к питательным средам.

5. Химический состав микробов.

6. Понятие о чистой культуре и колониях.

7. Методы выделения чистых культур аэробных микробов.

8. Этапы выделения чистой культуры аэробных бактерий.

9. Культуральные свойства бактерий.

10. Биологическое окисление у аэробных и анаэробных бактерий.

11. Методы культивирования анаэробов.

12. Методы выделения чистых культур анаэробов.

13. Значение ферментов в идентификации бактерий.

Тема:«Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Действие физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция»

Цель:

– научиться методам стерилизации лабораторной по-суды и

питательных сред.

Задачи:

– уметь правильно подобрать соответствующий метод стерилизации

различных объектов (среда, посуда, инструменты и т.д.);

– освоить основные группы дезинфицирующих ве-ществ и механизм

их действия на бактерии.

Во внешней среде на микробы действуют физические, хими-ческие и биологические факторы, которые или угнетают, или стимулирует их жизнедеятельность.

К физическим факторам относятся: высокая и низкая темпе-ратура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук, высокое давление.

Температура . Физиологическая деятельность любого микроорганизма приспособлена к определенному температурному оптимуму. По отношению к температуре все микроорганизмы делятся на психрофилы (от 0 до +10°С), мезофилы (от +20°С до +40°С) и термофилы (+50°С – +70°С). Большинство патогенных микроорганизмов относится к мезофилам.

Большинство микроорганизмов устойчивы к низким температурам (исключение составляют гонококки и менингококки).

Ферментативная активность бактерий

Высокая температура (+50°С – +60°С) губительно действует на вегетативные формы бактерий. Споры выдерживают кипячение до 2 часов. Губительное действие высокой температуры и лежит в основе методов стерилизации.

Основные противоэпидемические мероприятия

В лаборатории

Стерилизация

Стерилизация — удаление или уничтожение всех живых микроорганизмов (вегетативных и споровых форм) внутри или на поверхности предметов.

Стерилизация проводится различными методами: физическими, химическими,механическими.

Основные требования, предъявляемые к процессу стерилизации, отражены в отраслевом стандарте 42-21-2-82 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства, режимы».

Физические методы

Самым распространенным методом стерилизации является воздействие высокой температуры. При температуре, приближающейся к 100 °С, происходит гибель большинства патогенных бактерий и вирусов. Споры почвенных бактерий-термофилов погибают при кипячении в течение 8,5 часов. Микроорганизмы, попавшие в глубинные слои земли, или покрытые свернувшейся кровью, оказываются защищенными от воздействия высокой температуры и сохраняют свою жизнеспособность.

При стерилизации физическими методами применяют действие высоких температур, давления, ультрафиолетового облучения и др.

Наиболее простой, но надежный вид стерилизации — прокаливание . Его применяют при поверхностной стерилизации негорючих и теплоустойчивых предметов непосредственно перед их использованием.

Другим простым и легко доступным методом стерилизации считается кипячение . Этот процесс проводят в стерилизаторе - металлической коробке прямоугольной формы с двумя ручками и плотно закрывающейся крышкой. Внутри расположена вынимающаяся металлическая сетка с ручками по бокам, на которую кладут стерилизуемый инструмент. Основной недостаток метода заключается в том, что он не уничтожает споры, а только вегетативные формы.

При паровой стерилизации необходимо выполнение определенных условий, которые гарантируют ее эффективность и сохранение стерильности изделий в течение определенного срока. Прежде всего, стерилизация инструментов, операционного белья, перевязочного материала должна проводиться в упаковке. С этой целью используют: стерилизационные коробки (биксы), двойную мягкую упаковку из бязи, пергамент, влагопрочную бумагу (крафт-бумага), полиэтилен высокой плотности.

Обязательное требование к упаковке — герметичность. Сроки сохранения стерильности зависят от вида упаковки и составляют трое суток для изделий простерилизованных в коробках без фильтров, в двойной мягкой упаковке из бязи, бумаги мешочной влагопрочной. В стерилизационных коробках с фильтрами стерильность изделий сохраняется в течение года.

Стерилизация сухим жаром

Процесс стерилизации сухим жаром проводят в сухожаровом шкафу (в печи Пастера и др.) — металлическом шкафу с двойными стенками. В корпусе шкафа расположены рабочая камера, в которой имеются полки для размещения предметов для обработки, и нагревательные элементы, которые служат дляравномерного нагрева воздуха в рабочей камере.

Режимы стерилизации:

температура 150 °С – 2 часа;

температура 160 °С – 170 °С – 45 минут — 1час;

температура 180 °С – 30 минут;

температура 200 °С – 10-15 минут.

Необходимо помнить, что при температуре 160 °С бумага и вата желтеют при более высокой температуре - сгорают (обугливаются). Началом стерилизации является тот момент, когда температура в печи достигает нужной величины. После окончания стерилизации печь выключается, прибор остывает до 50 °С, после чего из него вынимают простерилизованные предметы.

Изделия в воздушном стерилизаторе можно стерилизовать без упаковки, но только в тех случаях, если они используются сразу же после стерилизации. В качестве упаковки может быть использована бумага мешочная, изготовленная по ГОСТ 2228-81, в ней изделия хранятся не менее 3-х суток.

Режим воздушной стерилизации представлен двумя значениями температуры – 160 °С в течение 2,5 часов, либо 180 °С – в течение 1 часа.

Стерилизация текучим паром

Этот вид стерилизации производится в аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Кохапредставляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата не плотно, для того,чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Начальный подогрев воды в приборе происходит в течение 10-15 минут.

Текучим паром стерилизуют материалы, которые разлагаются или портятся при температуре выше 100 °С — питательные среды с углеводами, витаминами, растворы углеводов и т. п.

Стерилизацию текучим паром проводят дробным методом – при температуре не выше 100 оС по 20-30 минут в течение 3-х дней. При этомвегетативные формы бактерий погибают, а споры сохраняют жизнеспособность и прорастают в течение суток при комнатной температуре. Последующее прогревание обеспечивает гибель этих вегетативных клеток, появляющихся из спор в промежутках между этапами стерилизации.

Тиндализация – метод дробной стерилизации, при котором прогревание стерилизуемого материала проводится при температуре 56-58 оС в течение часа 5-6 дней подряд.

Пастеризация – однократное нагревание материала до 50-65 °С (в течение 15-30 минут), 70-80 °С (в течение 5-10 минут). Используется для уничтожения бесспоровых форм микробов в пищевых продуктах (молоко, соки, вино, пиво).

Предыдущая1234567891011121314Следующая

Рассмотрим кратко факторы, определяющие скорость реакций, катализируемых ферментами, и вопросы об активировании и ингибировании ферментов.

Как известно, скорость любой химической реакции уменьшается со временем, однако кривая зависимости скорости ферментативных реакций от времени (см.

рис. 4.17) не имеет обычно той общей формы, которая характерна для гомогенных химических реакций. Уменьшение скорости ферментативных реакций во времени может быть обусловлено угнетающим действием продуктов реакции, уменьшением степени насыщения фермента субстратом (поскольку по мере протекания реакции концентрация субстрата снижается), частичной инактивацией фермента при заданных температуре и рН среды. Следует учитывать, кроме того, влияние скорости обратной реакции, которая может оказаться существенной по мере увеличения концентрации продуктов ферментативной реакции. Учитывая эти обстоятельства, при исследовании скорости ферментативных реакций в тканях и биологических жидкостях обычно определяют начальную скорость реакции в условиях, когда скорость ферментативной реакции приближается к линейной (в том числе при достаточно высокой для насыщения фермента концентрации субстрата).

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Из приведенного выше материала вытекает важное заключение, что одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата. При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис. 4.12 и 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически уже не ока­зывает влияния на скорость реакции; в этих случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен. Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае становится концентрация фермента.

Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентра­ции фермента. На рис. 4.18 представлена зависимость между скоростью реакции и повышающимися количествами фермента в присутствии насыщающих концентра­ций субстрата. Существующая линейная зависимость между этими величинами показывает, что скорость реакции пропорциональна количеству присутствующего фермента.

УАктивирование и ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции, т. е. активность фермента, определяется так­же присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые увеличивают скорость реакции и иногда модифицируют ее, вторые тормозят реакцию. Среди химических соединений, оказывающих влияние на активность ферментов, встречаются разнооб-

Таблица 4.4. Ферменты, активируемые металлами

Фермент	Металл	Фермент	Металл
Цитохромы	Fe	Амилаза	Са
Каталаза	»	Липаза	»
Пероксидаза	>>	Карбоангидраза	Zn
Триптофаноксидаза	»	Лактатдегидрогеназа	»
Гомогентизиказа	»	Уриказа	»
Аскорбатоксидаза	Си	Карбоксипептидаза	»
Тирозиназа	»	Пируваткарбоксилаза	Mg
Фенолоксидаза	»	Фосфатазы	»
Ксантиноксидаза	Мо	Фосфоглюкокиназа	»
Нитратредуктаза	»	Аргиназа	Mn
Альдегидоксидаза	»	Фосфоглюкомутаза	»
Некоторые пептидазы	Со	Холинэстераза	»

разные вещества. Так, соляная кислота активирует действие пепсина, желчные кис­лоты - панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа папаин и другие в значительной сте­пени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а некоторые также витамином С. Особенно часто в качестве активаторов служат (выступают) ионы двухвалентных и иногда одновалентных металлов. Полу­чены доказательства, что около одной четверти всех известных ферментов для про­явления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов. Мно­гие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза практически лишена ферментативной активности; более того, для действия этого фермента цинк не может быть заменен никаким другим метал­лом. Известны ферменты, действие которых активируется рядом металлов, в част­ности енолаза активируется Mg 2 + , Mn 2 + , К + . В табл. 4.4 приведены примеры участия металлов в действии некоторых ферментов ".

Относительно роли металлов в активирующем действии ферментов имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в ряде случаев ионы металлов (Со 2 + , Mg 2 + , Zn 2 + , Fe 2+) выполняют функции простетических групп ферментов или служат акцеп­торами и донорами электронов или выступают в качестве электрофилов или нуклео-филов, сохраняя реактивные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg 2+ через отрицательно заряжен­ную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфорных эфиров органи­ческих веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соеди­нений. В ряде случаев металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg 2+ активируют креатинфос-фокиназу благодаря образованию истинного субстрата - магниевой соли АТФ. На­конец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (напри­мер, ионов Са 2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отме­тить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов (эффекторов, см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостерическим центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы при физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказы­вают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пеп-

син, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторами принято называть вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Недавно открыты анти­ферменты (антиэнзимы), представляющие собой белки (или полипептиды), дей­ствующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина соевых бобов и сывороточный антитрипсин. Они образуют труднодиссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами. Иногда инги­битор может входить в состав сложных ферментов, например протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфорилирования - дефосфорилиро-вания в живых организмах. Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторными субъединицами, в част­ности, какова разница в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе про­теинкиназы и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов), приводят к инактива­ции фермента. Однако подобное инактивирование относительно неспецифично. Оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на один какой-либо фермент или группу родственных ферментов. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение по ряду причин. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента, а также его функциональных групп и химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, специфически связывающие ту или иную группу в молекуле фермента, выключая ее из сферы химической реакции. Так, йодацетат 1СН 2 -СООН, его амид и этиловый эфир, парахлормеркурибензоат ClHg-CgH 4 -СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существен­ное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R- S H+ICH 2 -COOH-«-HI+R- S -CH2-COOH

Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре. Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при иссле­довании природы множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько по электрофоретической подвижности, сколько по различию чувстви­тельности к одному и тому же ингибитору.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность хими­ческих реакций и природа участвующих ферментов. Таким образом, при применении йодацетата, фторида и других ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до молочной кислоты в мы­шечной ткани, насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежу­точных метаболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромокси-дазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэсте-разы - фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Рациональная химиотерапия - направленное применение лекарственных препара­тов в медицине - должна основываться на точном знании механизма действия этих препаратов на биосинтез ферментов, сами ферменты или их регуляцию в организме. Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательные ингибиторы. Так, ингибитор трипсина, химотрипсина и калликреина - трасилол - широко приме­няется для лечения острого панкреатита. Избирательное ингибиторное действие не­которых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты служит основой для разработки эффективных методов синтеза химио-терапевтических препаратов. Этот путь открывает широкие возможности для регу­ляции синтеза ферментов и интенсивности метаболизма.

Типы ингибирования. Различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию функциональ­ных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количесгвен-ному изучению на основе уравнения Михаэлиса - Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, име­ющими структуру, похожую на субстрат, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Классическим примером подобного типа ингибирования явля­ется торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фу-маровую:

Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сход­ства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом переноса водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат)

все же несколько отличаются, они конкурируют за связывание с активным центром,! и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната: и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Этот тип ингибирования" иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 4.19). В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом (EI), в отличие от фермент-субстратного комплекса (ES) не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации EI-комплекса, или ингибиторную констан­ту (ATj), можно, следуя теории Михаэлиса - Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т. е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации Е1-комплекса.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболева­ний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являю­щейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В 6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипири-доксин и аминоптерин (см. главу 5), действуют как конкурентные, так называемые коферментные ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие биохимические процессы в организме.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющи­ми структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примерами необратимого ингибирования (инактивации) является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-п-нитрофенилфосфата и синильной кис­лоты, заключающееся в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэли-са - Ментен, Лайнуивера - Бэрка или другими, например уравнением Эди - Хофсти:

и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.

На рис. 4.20 видно, что при конкурентном типе ингибирования ингибитор уве­личивает значение К т (на величину, равную разнице в длине отрезков, отсекаемых на оси абсцисс), не оказывая влияния на максимальную скорость. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется молеку­лами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.21) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина К т не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, имеет место смешанный тип ингибирова­ния (иногда называемый частично неконкурентным типом), при котором снижение F max сочетается с одновременным увеличением К т. Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т. е. способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталити­ческому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата; для этого типа тормо­жения был предложен довольно неточный термин бесконкурентное ингиби-рование. Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соеди­нения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса ESI.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация по кинетике ферментативных реакций, освещающая возможный механизм ферментатив­ного катализа.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная сбалан­сированность катаболических (биодеградативных) и анаболических (биосинтетических) процессов. При этом в клетках одновременно совершаются процессы синтеза, рас­пада и взаимопревращения сотен и тысяч разнообразных веществ, которые регули­руются множеством регуляторных механизмов, обеспечивающих постоянство внутрен­ней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль принадлежит механизмам регуляции активности ферментов, будут рас­смотрены ниже.

_£Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой хими­ческой реакции, например: А + В <=* С + D концентрация компонентов реакции и со­ответственно направление реакции будут регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминиро-вания, катализируемой ферментом аланинаминотрансферазой:

Алании + а-Кетоглутарат +± Пируват + Глутамат

Этот тин регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, поскольку в ре­альных условиях реакция обычно протекает в одном направлении, так как образо­вавшиеся продукты могут оказаться субстратами для действия других ферментов и выводиться из сферы реакции; в этих случаях устанавливается скорее устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.

^Изменение количества фермента. На бактериях хорошо изучен феномен индуци­рованного синтеза ферментов при выращивании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или иной углевод, например глюкоза. Замена глюкозы в среде на лактозу приводит к индуцированному или адаптивному (после небольшого периода лагфазы) синтезу фермента галактозидазы (программи­рованному лактозным геном, см. главу 13), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу. В животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается сравнительно реже, и механизм, индуцирующий синтез, изучен только для неболь­шого числа ферментов (тирозинтрансаминазы, серии- и треониндегидратазы, трипто-фанпирролазы и др.). Однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцеро­генных веществ, алкалоидов, инсектицидов наблюдается резкое увеличение через несколько дней активности (соответственно количества) ферментов - гидроксилаз эндоплазматической сети клеток печени, окисляющих чужеродные вещества в неток­сичные для организма продукты. С другой стороны, описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило название летального синтеза.

"-■ Проферменты. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта и под­желудочной железы синтезируются в неактивной форме, в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к правращению проферментов в ак­тивные ферменты под влиянием специфических агентов. Так, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в форме трипсиногена. Последний превращается в актив­ный трипсин в кишечнике в результате аутокатализа или под действием других про-теиназ (см. главу 11). Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин осуществляется аутокаталитически в результате ограниченного протеолиза в присут­ствии соляной кислоты и также связано с отщеплением от профермента специфи­ческого ингибитора полипептидной природы. Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-предшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образу­ются проферменты.

Химическая модификация фермента. Некоторые белки при формировании третич­ной структуры подвергаются постсинтетической модификации (см. главу 1). Оказалось,

что ключевые ферменты энергетического обмена - фосфорилаза, гликогенсинтаза и др. - также контролируются путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинкиназой и протеинфосфата-зой, уровень активности которых в свою очередь регулируется гормонами. Уровень активности ключевых ферментов обмена углеводов и соответственно интенсивность и направленность самих процессов обмена определяются соотношением фосфорили-рованных и дефосфорилированных форм этих ферментов. Химическая постсинтети­ческая модификация ферментов включает, кроме того, процессы ограниченного про-теолиза, метилирования, гликозилирования и другие, обеспечивая тем самым микро­скопический тип регуляции активности ферментов и соответственно физиологическую скорость процессов обмена веществ.

Регуляция активности ферментов по принципу обратной связи. Во многих строго биосинтетических реакциях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализи­рующего первую стадию.

Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собственным ферментом:

Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значительной степени определяется концентрацией конечного продукта (Р), накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное ингибирующее действие на первую стадию процесса, соответственно на фермент E t .

Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было показано у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и ЦТФ. Оказалось, что изолейцин, являющийся конечным продуктом, избирательно подав­ляет активность треониндегидратазы, катализирующей первое звено процесса превра­щения треонина в изолейцин, насчитывающего пять ферментативных реакций. Ана­логично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказывает ингибирую-щий эффект на первый фермент (аспартаткарбамоилтрансферазу), регулируя тем самым свой собственный синтез. Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах, и в настоящее время он рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного метаболизма в целом".

С другой стороны, в амфиболических процессах, выполняющих одновременно биосинтетические и биодеградативные функции 2 , доказано существование регуляции как по типу ретроингибирования, так и макроэргическими соединениями - индика­торами энергетического состояния клетки. Для амфиболических процессов уникаль­ным типом регуляции, свойственным только им, является, кроме того, актива­ция предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирую­щее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося предшественником гликогена, на фер­мент гликогенсинтазу.

Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны аллостерическим (регуляторным) ферментам, когда эффектор, структурно отличаясь от субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, пространственно удаленном от активного центра. Взаимопревра­щения активного и неактивного аллостерического фермента в упрощенной форме, а также конформационные изменения, наблюдаемые при присоединении субстрата и эффекторов, представлены на рис. 4.22. Присоединение отрицательного эффектора к аллостерическому центру вызывает значительные изменения конфигурации актив­ного центра молекулы фермента, в результате чего фермент теряет сродство к своему субстрату (образование неактивного комплекса).

Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора, в част­ности в S-образности этих кривых (отклонение от гиперболической кривой Михаэли-са - Ментен). Это означает, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связывание второй молекулы в активном центре, способствуя тем самым увеличению скорости реакции. Кроме того, для аллостерических регуляторных фер­ментов характерна нелинейная зависимость скорости реакции от концентрации фер­мента.

Другие типы регуляции активности ферментов. Существует ряд других механиз­мов, контролирующих скорость метаболических процессов и активность внутри­клеточных ферментов. Абсолютное количество присутствующего в клетке фермента регулируется скоростью его синтеза и распада. К регуляторным механизмам могут быть отнесены также конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение актив­ности одного из изоферментов (у множественных форм ферментов), влияние кон­центраций кофакторов и явление компартментализации. Механизм ком-партментализации играет, по-видимому, важную биологическую роль, пространствен­но разъединяя с помощью биомембран ферменты со своими субстратами (например, лизосомальные ферменты: протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидро­литические ферменты, с цитоплазматическими веществами, на которые они действуют). Кроме того, этот механизм позволяет разделить несовместимые в одно и то же время метаболические процессы. Примером последних могут быть пути синтеза жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада жирных кислот, сосредоточенные в митохондриях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласован­ных условиях измерения. Лри оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна

концентрации фермента. О ско­рости ферментативной -реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости об­разования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности Комиссия по ферментам Международного биохимического союза реко­мендовала стандартную между­народную единицу (Е или U): ! за единицу активности любого фермента принима­ется то количество его, которое в оптимальных условиях ката­лизирует превращение 1 микро­моля субстрата в минуту (мкмоль/мин). В связи с введе­нием Международной системы единиц (СИ) предложено новое определение ферментной едини­цы катал (кат, kat); 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реак­цию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). От­ношение международной еди­ницы (Е) к каталу можно вы­разить следующим образом: 1 кат=1 моль -с" " = 60 моль х х мин " = 60 10 6 мкмоль х х мин" 1 = 6 10 7 Е; или 1 Е = = 1 мкмоль мин ~" =

= (1/60) мкмоль с " = = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Та­ким образом, 1 Е фермента соответствует 16,67 нкат._23

Рекомендовано, кроме того, проведение измерения единиц фермента при 25 °С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субртрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользу­ются производными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в се­кунду, принято называть числом оборотов, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44 000 мо­лекул перекиси водорода 1 .

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки (ядро, митохондрии, лизосомы и др.) является чрезвычайно важным, особенно в препара­тивной энзимологии, когда перед исследователем поставлена задача изолировать и выделить фермент в чистом виде. Сравнительно легко обнаружить локализацию фермента методами цито- и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкуби­руют с соответствующими субстратами, и после инкубации локализацию продукта реакции открывают добавлением подходящих реактивов по развитию специфической окраски.

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей. Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре 0 - 4 °С. Примерная схема дифференциального центрифугирования гомо­генатов в высокоскоростных центрифугах представлена на рис. 4.23 ". Обычно распре­деление ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изоли­рованных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фрак­ции микросом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из нее уда­ется изолировать частицы, известные как лизосомы, размер которых занимает про­межуточное место между размерами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку она происходит в основном из элементов эндоплазматической сети неоднородного строения.

При помощи метода фракционирования в центрифугах было показано, что ядер­ная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основным местом синтеза белка, как теперь установлено, является фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в растворимой фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты цикла Кребса локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями связаны также ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование и распад жирных кислот. Фермен­ты, катализирующие биосинтез жирных кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы.

Для изолирования и выделения ферментов из биологических объектов в чистом (гомогенном) состоянии используется весь арсенал методов выделения белков в ин­дивидуальном виде, который был подробно рассмотрен выше (см. главу 1).

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Современная классификация и номенклатура ферментов была разработана Ко­миссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждена на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве 2 .

Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стреми­тельным ростом числа вновь открываемых с каждым годом ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более того, для одного и того же фермента подчас употребляли два или несколько названий, что вносилу путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не от­ражали тип катализируемой реакции.

До 1961 г. не было единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали различ­ные принципы. Комиссией были рассмотрены три принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип - хими­ческая природа фермента, т. е. принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфат-протеинам, гемопротеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип - химическая природа субстрата, на который действу­ет фермент; по этому принципу трудно классифицировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное множество промежуточных продуктов обмена. В основу принятой классификации положен тре­тий принцип - тип катализируемой реакции, который является специфич­ным для действия любого фермента; этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с назва­нием субстрата (субстратов) и служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно этой классификации ферменты делят на шесть главных клас­сов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы).

Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисле­ния. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидо-редуктаза», например лактат: НАД" 1 " оксидоредуктаза для ЛДГ.

Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кисло­род, анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на про­межуточный субстрат, но не на кислород, цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относятся также гемсодержащие ферменты ка-талаза и пероксидаза, катализирующие реакции с участием перекиси водорода.

Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наиме­нование их составляется по форме: «донор: транспортируемая группа - трансфераза».

Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азо­тистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Например: метил- и фор-милтрансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др.

Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молеку­лы воды. Наименование их составляется по форме: «субстрат - гидролаза». К ним относятся: эстеразы - ферменты, катализирующие реакции гидролиза и синтеза слож­ных эфиров гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей, фосфатазы и пеп-тидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей амидазы, ускоряющие разрыв кислотно-ангидридных связей, отличных от пептид­ных, и др.

Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв С-О, С-С, С-N и других связей, а также обратимые реакции отщепления различных групп

от субстратов не гидролитическим путем; эти реакции сопровождаются образование»!

двойной связи или присоединением групп к месту двойной связи. Ферменты обозна*!

чаются термином: «субстрат -лиазы». Например, фумарат-гидратаза (систематичен

ское название: L-малат-гидролиаза) катализирует обратимое отщепление молекулй;

воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу"

входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и др.

Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие различные

типы реакций изомеризации. Систематическое название их составляется с учетом

типа реакции: «субстрат - цис-транс-изомераза». Если изомеризация включает внутри­молекулярный перенос группы, фермент получает название мутазы.

К классу изомераз относят рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные, внутримолекулярные оксидоредуктазы, ка­тализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз, внутримолекулярные трансфера-зы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и т. д.

Лш азы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составляют по форме: «X: Y лигаза», где через X и Y обозначаются исходные вещества. В ка­честве примера можно назвать L-глутамат: аммиак лигазу (глутаминсинтетазу), при участии которой из глутаминовой кислоты и аммиака в присутствии АТФ синтези­руется глутамин.

СПИСОК ФЕРМЕНТОВ

На основании разработанной системы, которая служит основой как для класси­фикации, так и для нумерации (индексации) ферментов, Международная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г. примерно из 900 ферментов. В списке фермен­тов (см. Номенклатуру ферментов, 1979) насчитывалось уже 2142 индивидуальных фермента; к настоящему времени их идентифицировано еще больше. В списке для каждого фермента, помимо номера (шифра), приводятся систематическое (рациональ­ное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую ката-, лизирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Присвое­ние номера для каждого фермента рекомендуется проводить по четырехзначному шифру.

Таким образом, шифр каждого фермента содержит четыре цифры, раз­деленные точками, и составляется по следующему принципу. Первая цифра указы­вает номер одного из шести главных классов ферментов. Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на при­роду той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз - на тип гидролизуемой связи и т. д. Эти подклассы в свою очередь делятся на более частные подгруппы (обозначаемые подподклассами), отличающиеся химической природой соединений (доноров или акцепторов), участвующих в данной подгруппе реакций. Номер, точнее цифра, подподкласса ставится на третьем месте в шифре фермента. У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз - тип отщепляемой группы и т. д. Первые три цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер в алфавитном порядке, который ставится на четвертом месте в шифре.

Таким образом, каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью четырех цифр, имеет соответствующий шифр, под которым он внесен в список фер­ментов. В качестве примера в табл. 4.5 приводятся два фермента из списка.

Таблица 4.5. Фрагмент	из списка ферментов
	Рекомендуемое		Систематическое	Примечания о специфич-
Шифр	(рабочее)	Реакция	название	ности и другие
	название			зависимости
КФ 1.1.1.27	Лактатдегид-	L-лактат + НАД+ =	L-лактат:	Окисляет и другие
	рогеназа	пируват + НАДН 2	НАД + -оксидоре-	оксимонокарбоновые
			дуктаза	кислоты
КФ 2.6.1.5	Тирозинами-	L-тирозин + 2-оксо-	L-тирозин:	Протеин пиридок-
	нотрансферача	глутарат = 4-оксифе-	2-оксоглутарат	сальфосфата. Фени-
		нилпируват + L-глу-	аминотрансфера-	лаланин может дей-
		тамат	за	ствовать вместо ти-
				розина

Следует особо отметить, что Международную классификацию ферментов нельзя считать абсолютно совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соот­ветствует общепринятой в органической химии классификации химических реакций, несмотря на то, что ферменты катализируют по существу те же реакции.

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и опреде­лить его варианты (так называемые биовары). Рассмот­рим основные ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окра­ску среды. Поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скопле­нию его в «поплавке» на жидких средах. «Поплавок» - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращен­ным вверх, которую до стерилизации помещают в пробир­ку со средой.

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбра­живая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщеп­ление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеп­лять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих жела­тин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен. Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока -оно приобретает вид молочной сыво­ротки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавлива­ют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 - 6 см. и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводо­рода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает пок­раснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Помимо указанных сред, способность микроорганиз­мов расщеплять различные питательные субстраты опре­деляют с помощью бумажных дисков, пропитанных опре­деленными реактивами (системы индикаторные бумажные «СИБ»). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37 °С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эрит­роциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

СОХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР

Выделенные и изученные культуры (штаммы), пред­ставляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля меди­цинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур - лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4 °С, лучше при -30-70 °С.

Восстановление высушенных культур.

Сильно нагрева­ют кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампу­лы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.

Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылить­ся находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры Можно также в жидком азоте (-196 °С) в специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следу­ющие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Меж­ду пересевами культуры хранят при 4 °С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столби­ком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганиз­мов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хра­нение при -20-70 °С; 4) хранение в запаянных пробир­ках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.

Глава 8. ФАГИ

Фаги - вирусы бактерий и ряда других микроорганиз­мов. В определенных условиях они вызывают лизис (растворение) своих хозяев. Действие фагов проявляется в природе и используется в практике.

Рис.42 Бактериофаги

История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Га­малея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов, В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исче­зали и что агент, лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность ра­створять свежие культуры микроорганизмов. Явление лизиса микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д"Эреллю.

Д"Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, кото­рые брал ежедневно у больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура выраста­ла. Но однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления больного.

Д"Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята большинством ученых.

Открытый вирус д"Эрелль назвал бактериофагом- пожирателем бактерий (от греч. фагос -пожирающий), а явление - бактериофагией.

С открытием электронного микроскопа была подтвер­ждена корпускулярная природа фага и изучена его морфо­логия.

Открытие д"Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и профилактики ряда инфекцион­ных болезней. В настоящее время фаги широко использу­ют в медицинской практике и при различных биологиче­ских исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.

СВОЙСТВА ФАГОВ

Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее изучены Т-фаги кишечной палочки). Их отросток представ­ляет собой полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной пластинкой с шипами и фиб­риллами. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком, без отростка и нитевидные

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой прохо­дит через последовательные стадии. Весь цикл занимает в разных системах фаг -бактерия от нескольких минут до 1-2 ч. Разберем последовательность этого процесса на примере Т-четного фага кишечной палочки.

Стадия I - адсорбция частиц фага на поверхно­стных рецепторах клетки осуществляется с помощью нитей хвостового отростка. На одной клетке могут адсор­бироваться сотни фагов (для лизиса клетки достаточно одного). Адсорбция фагов специфична.

Стадия II - проникновение (инъекция) нуклеино­вой кислоты фага в клетки у разных фагов происходит по-разному. У Т-фагов кишечной палочки шипы базальной пластинки соприкасаются с клеточной стенкой. Стержень «прокалывает» клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке, чаще всего лизоцим, разрушает цитоплазматическую мембрану. При этом чехол отростка сокращается, и через канал стержня нуклеиновая кислота фага «впры­скивается» в клетку. Пустая белковая оболочка фага («тень») остается снаружи.

Стадия III - репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки.

Стадия IV - сборка и формирование зрелых частиц фага.

Рис.43 Строение фага.

1 - головка; 2 - ДНК; 3 - стержень; 4 - чехол; 5 - базальная пластинка; 6-шипы; 7 - хвостовые фибриллы.

Рис.44 Морфология фагов.

1- фаги с головкой, отро­стком и сокращающимся чех­лом; 2--головка и отросток, без сократительной способно­сти; 3 - головка и короткий отросток; 4 -бесхвостые фа­ги; 5--нитевидные фаги.

Стадия V-лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Обычно происходит разрыв клеточной стенки и в окружающую среду выходит несколько сот новых фагов, способных поражать свежие клетки. Такой лизис называется лизисом изнутри.

В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке адсорбируется сразу очень боль­шое количество фагов. Они проделывают в клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытека­ет содержимое клетки. Таким образом, при лизисе извне фаг не размножается, и количество его частиц не увеличи­вается.

По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в окружающую среду большого количе­ства фаговых частиц, способных поражать новые клетки. При этом культура микроорганизмов лизируется. Жидкая среда становится прозрачной - происходит образование фаголизата - среды, в которой находится большое количество фагов. При развитии вирулентного фага в бактериях, растущих на плотной среде, образуются или прозрачные участки сплошного лизиса, или вырастают отдельные прозрачные образования - колонии фага. Их называют негативными колониями (бляшками). Колонии - разных фагов отличаются по величине и структуре.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популя­ции. С частью из них фаги вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в хромосому клетки и получает название про Фаг. Проис­ходит образование единой хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профаг, ставший частью генома клетки, при ее размножении может передаваться неограниченному числу потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) носит название л и з о г е н и я, а культура, в которой имеется про фаг, называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно поки­дать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превра­щаться в вирулентный фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают (лизируются), остальные сохраняют лизогенность.

Схема основных этапов взаимодействия фага с бактери­альной клеткой.

1 – внедрение нуклеиновой кислоты фага в клерку; 2-молодые, размножающиеся

фаги; 3 -зрелые фаги; 4 - выделение фагов.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно увеличиваются.

Умеренные фаги могут принести вред микробиологиче­скому производству. Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехо­да умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного штамма.

Умеренные фаги являются мощным фактором измен­чивости микроорганизмов. Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а клетка получит новые свойства.

Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах, выделени­ях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются хозяевами специфических для них фагов.

Устойчивость фагов к физическим и химическим факто­рам выше, чем у вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до.75°С, длительное высушива­ние, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиоти­кам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничто­жающих сопутствующую микрофлору. Поэтому эти веще­ства используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и дезинфицирующие вещества губительны для фагов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ

Применение фагов основано на их строгой специфично­сти и способности разрушать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.

Фагопрофилактика и фаготерапия-предупреждение и лечение инфекций с помощью фагов основаны на том, что, встречая в организме больного возбудителя болезни, фаг уничтожает его. В настоящее время фаги широко применяют при лечении и профилактике стафилококковых и стрептококковых поражений, даже таких, которые не поддаются действию антибиотиков, а также холеры, чумы и ряда других инфекций, например, инфекций, вызванных кишечной палочкой и протеем.

Фагодиагностика включает: а) идентификацию выде­ленных культур с помощью известных (диагностических) фагов. Культура соответствует тому фагу, который ее лизировал. Например, если лизис вызвал холерный фаг, то это культура холерного вибриона. Строгая специфич­ность типовых фагов дает возможность типировать вари­анты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд других вопросов; б) определение неизвестного фага по тест-культуре микробов. Если фаг лизирует культуру возбудителя дизентерии, то это дизентерийный фаг; в) ускоренный метод диагностики с помощью реак­ции нарастания титра фага РНТФ не требует выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон.

Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов биологии. С их помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей: при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.

ПРЕПАРАТЫ ФАГОВ

При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо изученными штаммами микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата.

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), в таблетках и свечах. Таблетка фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты желудочного сока.

Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и хранению фага.

Понятие активности фермента

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность - более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:

• масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата;
• время, потраченное на реакцию;
• количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие - это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей - бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества - моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени - минута, час, секунда,
• единицы массы или объема - грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные - катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т. д.

Например, известно,

2. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях - оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

Во многих случаях истинное молярное количество фермента неизвестно. Поэтому принято о количестве фермента судить по скорости реакции, которую он катализирует в определенных условиях измерения. Определение активности фермента - это косвенное определение его количества, так как скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации действующего фермента.

По решению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза (1961) за международную единицу активности фермента принимается такое его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в одну минуту при 30°С (мкмоль/мин). Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка или на 1 мг препарата.

Согласно международной системе мер (1972) рекомендована новая международная единица активности фермента - катал. Катал соответствует количеству фермента, способному вызвать превращение 1 моль субстрата в продукт в одну секунду (моль/с).

Отношение прежней единицы активности фермента к ка- талу составляет мкмоль/мин - 60 мкмоль/с - 16,67 нмоль/с. Следовательно, единица активности фермента соответствует 16,67 нкат.

Нормальное функционирование органов и тканей организма является отражением координированного функционирования всех регуляторных систем, включая ферментные. Можно полагать, что изменение активности одного фермента или его отсутствие приводит к нарушению постоянства метаболизма. При любой этиологии болезни, инфекционной или инвазионной, возникают изменения активности ферментных систем, и в этом смысле все болезни рассматриваются как метаболические.

По причине нарушений определенных ферментных систем в организме выявлены многие болезни животных и человека. Так, известны анемии, вызываемые недостатком в эритроцитах пируваткиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, метге- моглобинредуктазы. Часто патогенез патологического процесса нелегко определить. Чтобы выяснить, какая ферментная система нарушена, следует изучить многие факторы; необходима тканевая биопсия, выбор соответствующих диагностических реакций, активаторов или ингибиторов фермента.

Необходимость определения активности сывороточных ферментов основана на предположении, что изменения их активности отражают изменения, происходящие в определенном органе. Можно выявить в сыворотке ферменты двух типов: один является специфическим для сыворотки, выполняя конкретную роль, тогда как другой тип фермента обычно присутствует в сыворотке в очень низкой концентрации и не несет определенной функции.

При ряде патологий (инсульт) возможны изменения клеточной проницаемости и увеличение числа разрушенных клеток, что приводит к выходу внутриклеточных ферментов в плазму. В этих случаях первыми в плазме обнаруживаются ферменты низкой молекулярной массы.

В диагностике патологии отдельного органа было бы идеально определить активность фермента, характерного для данного органа. Однако это невозможно осуществить, поскольку метаболизм в разных органах протекает одинаково. И все же можно установить тканевые или органоспецифические ферменты, активность которых отражает функцию определенных тканей или органов. Например, повышение активности кислой фосфатазы в крови характеризует наличие опухоли простаты; повышение активности лактатдегидрогеназы и креатинфосфо- киназы в сыворотке крови является весьма информативным диагностическим тестом, который отражает повреждение сердечной мышцы. Увеличение активности изоферментов ЛДГ^ и ЛДГ 2 в сыворотке крови указывает на инфаркт миокарда, повышение активности ЛДГ и аспартатаминотрансферазы свидетельствует о распаде клеточных элементов в костном мозге. Связь между активностью ферментов и патологическим процессом не всегда объяснима, но эти данные, несомненно, имеют большой клинический интерес.