Трансформация - изменение наследственных свойств клетки в результате проникновения или искусственного привнесения в нее чужеродной ДНК. Природу трансформирующего фактора установили Эвери, Мак-Леод в 1944. Трансформировать удается только те бактерии, в клетки которых может проникнуть высокомолекулярная, двуХцепочечная (интактная) ДНК. Способность поглощать ДНК – компетенция, и зависит от физиологического состояния клетки. ДНК может поглощаться в определенную короткую фазу изменения клеточной поверхности. С помощью ДНК могут передаваться такие признаки как: капсулообразование, синтез в-в, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам.. Любая ДНК может проникнуть в компетентную клетку, но рекомбинация роисходит только ДНК родственного вида. Конъюгация - перенос генетического материала путем прямого контакта между 2 клетками. Исследовали Ледерберг и Татум в 1946 на мутантах Кишечной палочки. Один мутант уждался в аминокислотах А и В, но был способен синтезировать Си Д, второй был ему компетентен (А-В-С+Д+). Эти мутанты не росли и не образовывали колоний на минимальной, питательной среде, но если внести на нее суспензию обоих мутантов, то колонии появлялись. Клетки этих колоний обладали наследственной способностью синтезировать все аминокислоты (А+В+С+Д+).Здесь предпосылкой рекомбинации служит конъюгация. При исследовании бактерий выяснили, что способность клетки быть донором связана с наличием фактора F (F +клетки, не содержащие фактора – F- и может функционировать, как реципиент) – плазмида, кольцевая, двухцепочечная молекула ДНК. Т.о. клетки реципиенты в результате конъюгации становятся донорами, а хромосомные признаки не передаются. F-плазмида обуславливает образование на клетке половых фимбрий/ F-пили, которые служат для узнавания при контакте м/у клеткой донором и клеткой реципиентом и делают возможным образование мостика, по которому ДНК переходит в клетку. Конъюгация распространена у энтеробактерий, прокариот. Трансдукция - пассивный перенос бактериальных генов из одной клетки в другую частицами бактериофага, что приводит к изменению наследственных свойств клетки. Различают 2 вида трансдукции: а) Неспецифический - при котором может быть перенесен любой фрагмент ДНК хозяина (ДНК клетки хозяина включается в частицу фага/ к его собственному гену/ вместо него) ; б) Специфический – может быть перенесен строго определенный фрагмент ДНК некоторые гены фага заменяются генами хозяина). В обоих случаях фаги дефектны, т.е. теряют способность лизировать клетку.

38. Факторы резистентности(r-факторы). Свойства плазмидов. Транспозоны.

1. Резистентность – устойч.орг-мов к каким-либо антигенам. Бактерии устойч.к некотор.антаибиотикам были откр. В 50-е годы в Японии(возбудители дезинтерии. Отмеч.множ.уст-ть бакт.дезинтерии и это может перед.др.бакт. R-факторы содержат гены, которые делают клетку устойчивой к некоторым антибиотикам. Некоторые R-факторы обуславливают резистентность сразу к 8 антибиотикам, а др. R-ф. придают уст-ть к тяж.мет.(ртуть, никель, кадмий) R-плазмида несёт 2 гр.генов:1)ген отв.за передачу плазмиды путём коньюгации(гены tra) и они обр.так назыв.»факторы переноса устойчивости(RTF), 2)гены котор.обусл.собственно резист-ть и они сост. Сост.лишь небольш.часть плазмиды.

RTF включ.все гены,ответств.за перенос фактора R из клетки в клетку, котор.осущ.путём коньюгации. Т.е фактор R также как и фактор F- инфекционен. Возможен перенос R-фактора между несколькими разными родами бактерий, что способств.их дальнейшему распр. Фермитативн.хим.модиф.антибиотиков явл.осн.причиной уст.к ним,обусл.плазмидами. Например канамицин и неомицин подверг.фосфорелиров-ю, а пинпиц.инактивиро.пеницилиназой. поск. При налич. R-факторов возможна генетт.рекомбинация, то может.возн.нов.сочет-е генов,котор.придадут.дополн.св-ва уст-ти. R-факторы имеют больш.знач-е для химио-терапии.

2. Бактериоцины . Многие бакт.синтез.белки,Юкотор. Убив.родств.виды или штаммы или тормозят их рост. Эти белки назыв-ся бактериоцинами. Они кодир. Особ.плазмидами, котор.назыв.бактериоциногенными факторами. Бактериоцины были выделены из эшрихиа коли(колицины) и др.бакт. Назв-е бактериоцинам даётся по продуцир.форме бакт.,напр.стафилококи произв.стафилоцины. неорг.в-ва, убив.бакт.назыв.антисептиками.

3. Др.призн., опр.плазмидами. Плазмиды могут содерж.гены,котор.обусл.ряд специф.биол.св-в,котор.в опр.усл-ях созд.селективное преимущество. Гены ферментов,необх.для расщепл-я камыфоры,салиц.к-ты и др.необ.субстратов могут наход.в плазмидах. Перечень св-в, наслед.с плазмидами, значит-й и включает: азотфиксацию,обр-е клубеньков, погл-е сахаров, синтез гидрогеназы и др. Некотор.из этих св-в могут опр.генами бактер. Хромасомы (обмен генами м-ду хромосомой и плазмидой). Плазмиды сыграли важн.роль в эвол.прокариотов.

4. Несовместимость. Многие бакт.содерж.плазмиды разл.велич. Сосущ.разн.плазмидов в одной клетке говорит о том, что такие плазмиды совместимы между собой. Но 2 родств.плазмиды не могут сосущ.в одной клетке,они несовместимы. Все плазмиды подр.на гр.несов-ти: плазмиды,отн.к одной и тойже группе несовм.

Транспозоны – это послед-ти ДНК,котор.способны встр.во мног.уч-ки генома и могут «перепр.»с плазмиды на бакт.хромосому,на др.плазмиду. Транспазоны содержат гены,котор.опр.внешнерасп.признаки,а именно уст-ть к таким антибиотикам как пиниц.,тетрациклин и др. В с вязи с этим их легче обнар., чем IS – Эл-ты (чужеродн.ДНК,предст.собой инсерцион.посл-ти встреч в бакт.хромосомах и плазмидах.). По обе стороны от генов уст-ти, котор.нах.внутри транспозона распол 2 одинаков посл-ти,котор.могут идти в одном и томже или противопол.напр-ях. Эти повт.посл-ти оснований ДНК частично идентичны с IS – Эл-тами.

41. Эволюция м/оов.

Кл-ки всего живого от примитивных форм до высоко организованных состоят из одних и тех же структурных элементов и исп одни и теже механизмы для получения энергии и роста. В этом заключается биохимическое единство всех живых организмов. В процессе эволюции происходило становление и формирование различных форм живого. Для процесса эволюции жизни необходимо предст какие условия были на Земле, в кот оказалось возможным самозарождение жизни. В послед после формирования Земли период на ней происх активные биологич процессы, кот меняли ее облик и приводили к формированию земной коры, гидросферы и атмосферы. Когда органич в-ва на Земле накопились в большом количестве=>возникли условия, при котором мог совершиться переход от химич эволюции к возникновению первых самовоспроизводящихся живых существ. Для клет жизни характерно, что она всегда предст в виде опред структур, кот пространственно обособленны от внешней среды, но постоянно взаимод с ней по типу отк систем. Предполаг, что след этапом эволюции на пути возникн жизни было формирование определенной структурной организации – абиогенносинтезированных органических соединений. Они имели сферическую форму, диаметр 0,5-7мкм, напоминали кокковидные формы бактерий, содержали протеиноиды, кот обладали определенной стабильностью. При окрашивании по грамму было обнаружено, что микросферы, образованные из кислых протеиноидов - гр-, а основными протеиноидами – гр+. Этот этап переходный этап от химической к биологической эволюции и возникшая закономерность может быть определена как предбиологический естественный отбор. В дальнейшем предпол, что первыми прокариотами, кот могли появиться в водоемах, где было много органич в-ва были организмы, кот сущ за счет брожения и обладавшими основными функциями анаэробного обмена. Если предположить, что в водоемах имелись тогда и сульфаты, то след этапом эволюц явл эффективный транспорт электронов с созданием протонного потенциала как источника энергии для регенерации АТФ. Кроме того, было экспериментально показано, что на начальн этапе эволюц прокариоты могли воспроизводиться и передавать информацию потомству без участия нуклеиновых кислот. Для дальнейшей эволюции прокариот было необходимо создание специального аппарата, кот бы обеспечивал точное воспр полипептидов. Это привело к формированию нового механизма синтеза – матричного синтеза, в основе которого лежит использование свойств полинуклеотидов. Свойством полинуклеиновых молекул является способность к точному воспроизведению, основанное на принципе структурной комплиментарности.

Главное событие в эволюции: переход от первичной восстанавливающей атмосферы к атмосфере, содержащей кислород. У бактерий появился новый тип метаболизма – аэробное дыхание, что стало возможно в результате превр цитохромов в терминальные оксидазы, используя молекулы О 2 в качестве акцептора электронов. Предполагают, что 2 млрд лет назад уже сущ все фототрофные прокариоты, кот изв и сейчас. Прокариоты первично занимали много различ экологич ниш, кот затем постепенно уступили эукариотам. Выработка разнообразных типов метаболизма у прокариот была обусловлена простой структурной клеткой, высокоразвитой системой регуляции, быстрым ростом, наличием неск механизмов переноса генов.

42.ПАТОГЕН МИКРООРГ И ИММУНИТЕТ.

Иммунитет защищает нас от инфекционных агентов: бактерий, вирусов и простейших, т. е. защищает организм от всего чужеродного.

Инфекция – сложный биологический процесс, возникающий в результате проникновения патогенных микробов в организм и нарушения постоянства его внутренней среды.

Патогенность – это способность микроба определенного вида при соответствующих условиях вызывать характерное для него инфекционное заболевание. Следовательно, патогенность есть видовой признак.

В природной среде встречаются биологические загрязнители, вызывающие у человека различные заболевания. Это болезнетворные микроорганизмы, вирусы, гельминты, простейшие. Они могут находиться в атмосфере, воде, почве, в теле других живых организмов, в том числе и в самом человеке.

Наиболее опасны возбудители инфекционных заболеваний. Они имеют различную устойчивость в окружающей среде. Одни способны жить вне организма человека всего несколько часов; находясь в воздухе, в воде, на разных предметах, они быстро погибают. Другие могут жить в окружающей среде от нескольких дней до нескольких лет. Для третьих окружающая среда является естественным местом обитания. Для четвертых - другие организмы, например дикие животные, являются местом сохранения и размножения.

Часто источником инфекции является почва, в которой постоянно обитают возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены, некоторых грибковых заболеваний. В организм человека они могут попасть при повреждении кожных покровов, с немытыми продуктами питания, при нарушении правил гигиены.

Типичные антибиотики	Продуценты	На кого действует	Механизм действии	Трудности терапевтического применения
Пенициллины, це-фалоспорины	Грибы родов Ре nicillium , Cephalosporum	Грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии	Нарушение синте­за клеточной стенки	Аллергические реакции
Стрептомицин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, амикацин	Актиномицеты ро­да Streptomyces , бактерии родов Micromonospora . Bacil ­ lus		Необратимое подавление синтеза белка	Токсическое дейст­вие на слуховой нерв и почки
Одноименные антибиотики	Актиномицеты ро­да Streptomyces	Грамположительные и грамотрицательные бактерии, риккетсии, хламидии, простейшие	Обратимое подав­ление синтеза белка	Распространение устойчивых штаммов
Антибактериаль­ные: эритромицин Противогрибковые и антипротозойные: полиены	Актиномицеты ро­да Streptomyces То же	Грамположительные бактерии Грибы, некоторые простейшие	Нарушение плаз­матической мемб­раны	Токсичность
Полимиксины, грамицидины, бацитрацины	Различные микро-организмы	В основном грамотрицательные бак­терии	Механизм дейст­вия различен	Высокая токсичность

Мы познакомились с процессом удвоения ДНК, когда на одной цепи, как на матрице, выстраивается другая цепь. Однако в природе существуют процессы, связанные с изменением структуры ДНК, но эти изменения идут в других направлениях.

Трансформация – внесение в клетку генетической информации при помощи изолированной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Трансформация приводит к появлению у трансформированной клетки (трансформанта) и её потомства новых признаков, характерных для объекта - источника ДНК. Явление было открыто в 1928 английским учёным Ф. Гриффитом, наблюдавшим наследуемое восстановление синтеза капсульного полисахарида у пневмококков при заражении мышей смесью убитых нагреванием капсулированных бактерий и клеток, лишённых капсулы. Организм мыши в этих экспериментах играл роль своеобразного детектора, так как приобретение капсульного полисахарида сообщало клеткам, лишённым капсулы, способность вызывать смертельный для животного инфекционный процесс. В последующих экспериментах было установлено, что трансформация имеет место и в том случае, когда вместо убитых клеток к лишённым капсулы пневмококкам добавляли экстракт из разрушенных капсулированных бактерий. В 1944 О. Эйвери с сотрудниками (США) установил, что фактором, обеспечивающим трансформацию, являются молекулы ДНК. Эта работа - первое исследование, доказавшее роль ДНК как носителя наследственной информации.

Помимо пневмококков, трансформация обнаружена и изучена на некоторых других бактериях.

Трансформацию у бактерий рассматривают как сложный процесс, включающий следующие стадии:

Фиксация молекул ДНК клеткой-реципиентом;

Проникновение ДНК внутрь клетки;

Включение фрагментов трансформирующей ДНК в хромосому клетки-хозяина;

Формирование "чистых" трансформированных вариантов.

Фиксация ДНК происходит на особых участках клеточной поверхности (рецепторах), число которых ограничено. Связанная с рецепторами ДНК сохраняет чувствительность к действию добавленного в среду фермента дезоксирибонуклеазы, вызывающего её распад. Однако, спустя очень короткий срок (в пределах 1 мин) после фиксации, часть ДНК проникает в клетку. Бактериальные клетки одного и того же штамма резко различаются по проницаемости для ДНК. Клетки данной бактериальной популяции, способные включать чужеродную ДНК, называются компетентными . Число компетентных клеток в популяции незначительно и зависит от генетических особенностей бактерий и фазы роста бактериальной культуры. Развитие компетенции связывают с синтезом особого белка, обеспечивающего проникновение ДНК в клетку.

Средние размеры фрагментов ДНК, проникающих в клетку, составляют 5×106 дальтон. Поскольку в компетентную клетку может одновременно проникнуть ряд таких фрагментов, суммарная величина поглощённой ДНК может быть примерно равна размерам хромосомы клетки-хозяина. После проникновения в клетку двунитевой ДНК одна нить распадается до моно- и олигонуклеотидов, вторая - встраивается в хромосому клетки-хозяина путём её разрывов и воссоединений. Последующая репликация такой гибридной структуры приводит к выщеплению "чистых" клонов трансформантов, в потомстве которых закреплен признак, кодируемый включившейся ДНК.

Применение трансформации позволило провести генетический анализ бактерий, у которых не описано иных форм генетического обмена (конъюгации, трансдукции). Кроме того, трансформация – удобный метод для выяснения влияний на биологическую активность ДНК физических или химических изменений её структуры. Разработка метода у кишечной палочки позволила использовать для трансформации не только фрагменты бактериальной хромосомы, но и ДНК бактериальных плазмид и бактериофагов. Этот метод широко используется для внесения в клетку гибридной ДНК в исследованиях по генной инженерии.

Трансдукция (от лат. transductio - перемещение) – перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью вируса, что приводит к изменению наследственных свойств клеток-реципиентов. Явление трансдукции было открыто американскими учёными Д. Ледербергом и Н. Циндером в 1952. Особые бактериальные вирусы – умеренные фаги в процессе вегетативного размножения способны случайно захватывать и переносить в другие клетки любые участки ДНК лизируемых, то есть разрушаемых ими, бактерий (общая , или неспецифическая , трансдукция). Длина переносимого (трансдуцируемого) отрезка ДНК определяется размером белковой оболочки фаговой частицы и обычно не превышает 1-2% бактериального генома. Переносимый отрезок может содержать несколько генов. Поскольку вероятность такой сцепленной трансдукции зависит от расстояния между генами в молекуле ДНК, образующей хромосому бактерии, явление трансдукции широко используется при составлении генетических карт хромосом бактерий. Генетический материал фага в таких трансдуцирующих частицах отсутствует; поэтому, вводя ДНК в клетку, они не осуществляют все остальные функции фага: не размножаются, не лизогенизируют клетку и не наделяют её иммунитетом к фагу. Внесённый фрагмент может существовать в клетке в виде дополнительной генетического элемента, обладающего функциональной активностью. Поскольку такой фрагмент не способен воспроизводиться, при каждом клеточном делении он передаётся лишь в одну из дочерних клеток. За исключением этой клетки свойства всего остального потомства остаются без изменений (абортивная трансдукция). В дальнейшем фрагмент может быть либо разрушен, либо включен в хромосому бактерии, заменив в ней гомологичный участок ДНК. В последнем случае новые признаки, приобретённые клеткой-трансдуктантом, будут свойственны всему потомству этой клетки (полная трансдукция).

Существует группа бактериофагов, способных трансдуцировать лишь определённые гены, расположенные рядом с местом включения генома фага в хромосому бактерии при лизогенизации (ограниченная , или специфическая , трансдукция). Такие трансдуцирующие фаговые частицы, образующиеся в результате случайного нарушения точности процесса выхода профага из бактериальной хромосомы, содержат молекулу ДНК, состоящую из остатка фагового генома и фрагмента бактериального генома. В большинстве случаев они не могут самостоятельно размножаться или лизогенезировать бактерии из-за утраты части фагового генома (до 30%). Генетический материал трансдуцирующих частиц может сохраняться в клетке в автономном состоянии или в качестве профага включиться в ДНК бактерии. Однако в обоих случаях часть потомства восстанавливает исходные свойства из-за утраты профага. Стабильная трансдукция достигается только в случае включения бактериального фрагмента профага в геном бактерии в результате обмена на гомологичный участок хромосомы.

Эписомы (от эпи... и греч. sóma - тело) – генетические факторы, способные находиться в клетке либо в автономном (в цитоплазме) либо в интегрированном (включенными в хромосому) состоянии; представляют собой молекулы ДНК. К эписомам относятся геном умеренного фага лямбда, половой фактор F, некоторые R-факторы, сообщающие бактериям устойчивость к определённым лекарств, веществам, и некоторые др. Эписомы не являются обязательными компонентами клеток и могут переходить из одного состояния в другое, что зависит от вида клеток. Например, геном умеренного фага лямбда в клетках кишечной палочки может находиться в интегрированном либо в автономном состоянии, а в клетках возбудителя брюшного тифа – только в автономном состоянии. Находясь в автономном состоянии, большинство эписом ведут себя как типичные плазмиды. Ряд авторов видит в эписомах переходное звено между структурами, определяющими хромосомную и нехромосомную наследственность.

ДНК- диагностика

Организм человека является средой обитания для сотен видов бактерий и вирусов. С биологической точки зрения организм человека представляет собой целую систему сосуществующих организмов-симбионтов. Далеко не все из симбионтов патогенные. Без некоторых видов бактерий человек просто не способен существовать, их утрата или снижение количества является причиной развития ряда тяжелых заболеваний. Расшифровка геномов многих болезнетворных микроорганизмов с идентификацией всех белков поможет разработать методы предупреждения и лечения инфекционных болезней.

Для развития инфекционного процесса большое значение имеет генетический статус самого хозяина. Например, отдельные индивидуумы являются носителями вируса иммунодефицита, но СПИДом не болеют. У этих лиц имеется мутация в гене, кодирующем поверхностный белок, ответственный за попадание вируса внутрь лимфоидных клеток. Плотность белка на поверхности клеток снижена, вирус удерживается, но внутрь не попадает. Частота гомозигот по этой мутации среди жителей Европы составляет около 1%, они имеют выраженную устойчивость к ВИЧ-инфекциям. Более устойчивыми оказываются и гетерозиготные носители мутации, в российской популяции их частота достигает 13%.

Прокариотам несвойственно половое размножение . Рекомбинация у них происходит в результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора.

В результате рекомбинаций образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора.

Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцепленных генов. Существуют специальные гес-гены, детерминирующие рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала (хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации. Передача плазмидных генов - путем трансдукции и конъюгации.

Трансформация - изменение одного типа клеток при действии активного начала из другого типа клеток. Феномен открыл Гриффит у Streptococcus pneumoniae (1928); позднее Эвери, Маклеод и Мак Карти (1944) выделили трансформирующее начало пневмококков в форме молекулы ДНК. Это и явилось первым прямым доказательством того, что носителем генетической информации является ДНК.

Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Традиционно, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами. При некоторых условиях такая ДНК интегрируется в геном бактерий и изменяет его. Встраивание плазмидной ДНК может менять вирулентность бактерий. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Трансдукция - перенос фрагмента ДНК от одной клетки (донора) к другой (реципиенту) с помощью бактериофага. Явление открыл Ледерберг и Циндер (1952). Выделяют 3 типа трансдукции:

неспецифическая (общая) - в клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК может проникнуть любой фрагмент бактериальной ДНК или плазмиды. В этом случае, фаг утрачивает часть своего генома, становиться дефектным и способен вызвать трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.

специфическая характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Это связано с тем, что образование трансдуцирующего бактериофага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме в клетке-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента. Бактерии, лизогенированные дефектным фагом, невосприимчивы, как и все лизогенные клетки, к последующему заражению гомологичным вирулентным фагом.

абортивная. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т. е. наследоваться однолинейно и постепенно утрачиваться.

Конъюгация - перенос генетического материала их клетки-донора в клетку-реципиента при их скрещивании. Процесс конъюгации у бактерий впервые обнаружен Д. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г.Позднее выяснилось, что донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор). При скрещивании F + с F" клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора, если плазмида находится в автономном состоянии. При этом почти все реципиентные клетки получают F плазмиду и становятся F + клетками.

Этапы коньюгации:

прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок (sex pili).

образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент могут передаваться F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии.

Интеграция F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы приводит к разрыву одной из нитей ДНК, что обеспечивает возможность переноса в реципиентную клетку.

Постановка опыта трансдукции

Умеренный фаг, полученный при фильтровании из культуры E.coli в объеме 1 мл вносят в стерильную пробирку, затем в эту пробирку вносят 1 мл бульонной культуры E.coli, не способной расщеплять лактозу. Опытную пробирку выдерживают в термостате 40 мин. Затем делают высевы на сектора чашки со средой Эндо: умеренный фаг; E.coli lac-; из опытной пробирки.

Постановка опыта конъюгации

В отдельную стерильную пробирку вносят бульонную культуру донора и бульонную культуру реципиента в объеме по 1 мл. Опытную пробирку выдерживают в термостате 40 мин. Затем производят высевы культуры донора, реципиента и смесь донора с реципиентом на отдельные сектора минимальной питательной среды. Инкубируют 24 часа 37°С.

Генетические рекомбинации у эукариот - это образование индивидуумов с новым сочетанием признаков в результате полового процесса. Новая особь получает несколько генов от одного родителя и несколько от другого, генетически отличающегося родителя. Благодаря процессу рекомбинации увеличивается число наследственных изменений, на которые может воздействовать отбор.

У прокариот генетическая рекомбинация относится к так называемым парасексуальным процессам. У этих организмов известны три процесса, посредством которых генетический материал от двух различных родителей может рекомбинироваться. Это трансформация, конъюгация и трансдукция. Однако ни в одном из этих процессов не происходит истинного слияния клеток или полного слияния нуклеоидов. Лишь часть генетического материала клетки-донора передается клетке-реципиенту. Реципиент, таким образом, становится диплоидным, потому что часть его генетического материала дополняется генетическим материалом донора.

В такой неполной зиготе, называемой мерозиготой, сформированной в результате переноса генов, генетический материал реципиентной клетки называется эндогенным, а генетический фрагмент, переданный из донора,- экзогенным. Обычно экзогенная и эндогенная части соединяются и обмениваются сегментами немедленно после переноса.

Трансформация - это процесс переноса генов, при котором часть ДНК клетки-донора, полученная либо эстрагированием, либо при естественном лизисе клеток, может проникать в родственную (одного и того же вида или близкородственных видов) бактериальную клетку-реципиент. В результате происходит включение в ДНК реципиента фрагментов хромосомы ДНК донора, что обусловливает изменение признаков бактерии-реципиента.

Процесс трансформации можно подразделить на несколько стадий: 1 - контакт ДНК с поверхностью клетки; 2 - проникновение ДНК в клетку; 3 - соединение трансформирующей ДНК с соответствующим фрагментом хромосомы реципиента. Дальнейший процесс связан с рекомбинацией части экзогенной молекулы трансформирующей ДНК с реципиентной эндогенной хромосомной ДНК. Последняя стадия - репликация включенной в хромосому новой информации.

В лабораторных условиях трансформация осуществляется следующим образом. ДНК определенного штамма бактерий извлекают, очищают и смешивают с клетками бактерий другого штамма, отличающегося от первого одним или несколькими наследственными свойствами. Культуру подопытного микроорганизма оставляют расти. Среди потомства можно обнаружить небольшое количество клеток с некоторыми свойствами штамма, из которого была извлечена ДНК.

Очень редко бывает, что единичная бактериальная клетка приобретает в результате трансформации более чем одно новое свойство. Передача через ДНК большего числа признаков наблюдается лишь в том случае, если культура микроба-донора генетически близка к клеткам микроба-реципиента.

С помощью трансформирующей ДНК могут передаваться такие признаки, как капсулообразование, синтез необходимых клетке веществ, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и другим лекарственным веществам.

Трансформацию наблюдали у многих бактерий, в частности у представителей родов Bacillus, Rhizobium, Streptococcus и др.

Конъюгация - процесс, при котором сблизившиеся родительские клетки соединяются обычно с помощью конъюгационных мостиков, через последние происходит обмен генетическим материалам. Конъюгацию исследовали у различных бактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), в частности она хорошо изучена у Escherichia coli.

Возможность клетки стать донором определяется специфическим половым фактором F (от англ. fertility - плодовитость), который при конъюгации переносится из одной бактериальной клетки в другую. Эти клетки были названы F+-клетками. Клетки бактерий, не имеющие F-фактора, являются реципиентами генетического материала и обозначаются F - Половой фактор F относится к числу конъюгативных плазмид и представляет собой циркулярно замкнутую молекулу ДНК с молекулярной массой 64х106 а. е.м. F-плазмида обусловливает образование на поверхности клетки одной или двух так называемых половых фимбрий, или F-pili, способствующих соединению клеток-доноров с клетками - реципиентами, а также независимую от хромосомы репликацию собственной ДНК и образование продуктов, которые обеспечивают перенос генетического материала как самой F-плазмиды, так и хромосомы клетки. F-плазмида располагается в цитоплазме автономно, вне бактериальной хромосомы. Однако она обладает способностью включаться (иитегрировать) в определенные места бактериальной хромосомы и становиться ее частью.

В результате интеграции F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы образуется так называемый Hfr-штамм (High frequency of recombination - высокая частота рекомбинации). Когда происходит скрещивание Hfr-штамма с F - - бактериями, то, как правило, F - фактор не

Передается, а гены хромосомы бактерий передаются с довольно высокой частотой. В начале процесса конъюгации клетки-доноры F+ или Hfr соединяются с клетками-реципиентами (благодаря наличию у доноров F-pili). Впоследствии между клетками образуется конъюгационный мостик и через него, из клетки-донора в клетку-реципиент, передается генетический материал или F-плазмиды, или хромосомы. Обычно при конъюгации передается только одна цепь ДНК-донора, а вторая цепь (комплементарная) достраивается в клетке реципиента. Перенос, как правило, начинается с одного конца хромосомы и продолжается с последующим переносом других участков ее (рис. 21).

Переносу генетического материала можно препятствовать в любое время, разделяя конъюгирующие пары с помощью сильного встряхивания суспензии микроорганизмов, находящихся в жидкой среде. В этом случае только некоторые свойства мужских клеток переносятся в женскую клетку и могут проявиться в потомстве. Рано или поздно перенос прекращается в большинстве конъюгирующих пар и тогда, когда их искусственно не разделяют. Это происходит потому, что конъюгационный мостик непрочен и легко разрушается, не влияя на жизнеспособность клеток.

Таким образом, в результате конъюгации реципиентная клетка F - превращается в мерозиготу, содержащую из-за самопроизвольного прерывания переноса генетического материала только часть хромосомы-донора F+ в дополнение к собственной хромосоме. В результате процесса кроссинговера (перекрест хромосом, при котором гены меняются местами), наблюдающегося и у других организмов, образуется новая комбинация генетического материала. В зависимости от места расположения подвергающегося обмену генетического материала в потомстве могут возникнуть рекомбинанты разного типа.

Трансдукция - процесс переноса генетического материала от одной бактериальной клетки к другой посредством бактериофага. Другими словами, фаг при этом играет как бы роль гаметы, перенося в клетку - реципиент фрагмент ДНК клетки-донора. Трансдукция происходит при участии умеренных фагов.

Известны три главных типа трансдукции: общая (неспецифическая), локализованная (специфическая) и абортивная. При неспецифической трансдукции происходит передача различных фрагментов ДНК от бактерий-доноров к бактериям - реципиентам с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. При этом принесенный фагом фрагмент ДНК донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки - реципиента путем рекомбинации.

Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить от бактерий - доноров к бактериям - реципиентам только определенные гены. Это обусловлено тем, что образование трансдуцирующего фага происходит в результате соединения его ДНК со строго определенными бактериальными генами, расположенными на хромосоме клетки-донора. Считают, что каждая частица фага переносит или только один бактериальный ген, или несколько близколежащих генов.

При Абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент хромосомы клетки - донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а располагается в ее цитоплазме автономно и в таком виде может функционировать. В процессе деления клетки - реципиента трансдуцированный фрагмент ДНК - донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, то есть наследуется однолинейно, в связи, с чем утрачивается в потомстве.

При трансдукции возможен перенос генов, контролирующих питательные особенности бактерий, их устойчивость к лекарственным веществам, ферментативную активность, двигательный аппарат (жгутики) и другие свойства.

Перенос признаков с помощью процесса трансдукции обнаружен у представителей родов Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia и др.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМБИНАЦИИ у эукариот совершаются в процессе полового размножения путем взаимного обмена фрагментами хромосом, при этом из двух родительских хромосом образуются две рекомбинантные, т.е. возникают две рекомбинантные особи.

У прокариотов нет полового размножения Þ в результате внутригеномных перестроек: изменение локализации генов в пределах хро­мосомы, или при проникновении в # реципиента части ДНК донора → формирование мерозиготы, т.е. образу­ется только ОДИН РЕКОМБИНАТ.

ГенР происходят при участии ферментов в пределах отдельных генов или групп сцеплений ге­нов. Существуют специальные REC–ГЕНЫ, определяющие способность бактерий к рекомбинациям. Передача генетического ма­териала от Б! к Б! про­исходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации, а плазмидных генов - путем трансдукции и конъюгации.

ТРАНСФОРМАЦИЯ – непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора Рец#. (Впер­вые Гриффитс – опыт с живым авирулентным бескапсульным штаммом пневмококка, к/й стал вирулентным при обработке экстрактом убитых капсульных пневмококков.)

С донорной ДНК в реципиентную клетку обыч­но передается только один ген, т.к. фрагмент ДНК, который может проник­нуть в Рец# очень маленький. Трансформации поддаётся только часть клеток Б!! популяции – КОМПЕ­ТЕНТНЫМИ. Состояние компетентности (когда стенка Б! проницаема для высокополимерных (Мг=0,5–1 млн) фрагментов ДНК) возникает обычно в конце LOG–ФА­ЗЫ.

Фазы про­цесса трансформации:

1) адсорбция ДНК-донора на Рец#;

2) про­никновение ДНК внутрь Рец# и деспирализация ДНК.

3) соединение лю­бой из двух нитей ДНК донора с гомологичным участком хромосомы реципиента и последующая рекомбинацией.

Эффективность зависит от СТЕПЕНИ ГОМОЛОГИЧНОСТИ ДНК донора и реципиента, что определяет конечный результат, т. е. количество формирую­щихся рекомбинантов (трансформантов) Þ межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.

ТРАНСДУКЦИЯ – передача генетического материала с помощью фагов. Различают три типа трансдукции:

Неспецифическая (общая). В момент сборки фаговых частиц в их головку может проникнуть ЛЮБОЙ фрагмент ДНК Б!–донора. Вместе с фаговой ДНК пере­носятся любые гены донора и включаются в гомологичную область ДНК Рец# путем рекомбинации. Фаги только пере­носят генетического материала

Специфическая – фаг переносит ОПРЕДЕЛЕННЫЕ гены при выщеплении профага из Б! хромосомы вместе с рядом расположенными генами, при этом фаг становится дефектным. При взаимодействии фага с Рец# происходит включение гена донора и дефектного фага в хромосому РецБ!, а Б!! становятся не­восприимчивыми к последующему заражению вирулентным фагом.

Абортивная – фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому РецБ!, а располагается в цитоплазме и в таком виде функционирует. Во время деления этот фрагмент ДНК передаётся только одной дочерней #, и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.

КОНЪЮГАЦИЯ – перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при их СКРЕЩИВАНИИ. Доноры – ## с F-плазмидой (половой фактор). При скрещивании F+ с F– # половой фактор пере­дается независимо от хромосомы донора, при этом почти все Рец# становятся F+.

F-плазмида может интегрировать в Б! хромосому. В некоторых случаях она освобождается, захватывая при этом сцепленные с ней Б! гены (обозначаются с указанием включенного гена: F-lac).

1) прикрепление клетки-донора к Рец# с помощью SEX-ПИЛЕЙ

2) образование конъюгационного МОСТИКА, через который передаётся F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме донора.

3) разрыв одной из цепей ДНК (в месте включения F-плазмиды) при участии эндонуклеазы. Один конец ДНК проникает в Рец# и сразу же достраивается до 2-нитевой структуры. При переносе захватывается часть ДНК Б!-донора – Hfr-штаммы (HIGH FREQUENCY OF RECOMBINATION). При скрещивании Hfr-штамма с F–# F-фактор, не передается (т.к. конъюгационный мостик разрывается, а F-фактор расположен в дистальной части хромосомы). Передаются только гены Б! хромосомы, расположенные вблизи начала переноса (О–точка (origin)).

4) На ОСТАВШЕЙСЯ в # нити ДНК синтезируется 2 цепочка.

22. Споры и спорообразование у микроорганизмов, свойства спор, методы обнаружения спор.

Спорообразование наблюдается в условиях, неблагоприятных для вегетативных форм. У бактерий выделяют 3 вида спор:

– ЭНДОСПОРЫ (истинные споры) – располагаются внутри#, имеют высокий коэффициент светопреломления.

– АРТОСПОРЫ – обр-ся в рез фрагментации вегетирующих Б!!

– ХЛАМИДИОСПОРЫ (микроцисты) – формируются в рез утолщения стенок вегетирующей # и накопления запасных пит в-в.

К спорообразованию способна лишь небольшая группа эубактерий, а из патогенных для чка только – Clostridium и Bacillus. Каждая вегетативная # образует 1 эндоспору. Споры УСТОЙЧИВЫ к t°С, высыханию, радиации и химическим в-вам (включая 70° этанол). Могут сохраняться оч длительное время. Предположительно споры могут храниться в сухой почве до 1000 лет, но фактически уже за 50 лет 90% спор теряют жизнеспособность.

Морфологически споры м.б. круглыми, овальными, эллиптическими, некоторые снабжены «рёбрами жесткости».

ПРОЦЕСС СПОРУЛЯЦИИ начинается сразу при возникновении дефицита питательных в-в и длится около 8ч, при этом никаких внешних источников питания или энергии не требуется. Стимулируют – глюкоза, Р и NH 4 , угнетают –пептон, лактоза, NaCl, CaCl 2 . Выделяют след ЭТАПЫ:

1) Подготовительная стадия – прекращается деление, начинается накопление липидных включений.

2) Стадия предспоры – появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с изменённой плотностью и тинкториальными свойствами.

3) Формирование оболочки

4) Стадия созревания споры – происходит её уплотнение и прекращение любых перемещений в #–спорангии.

5) Разрушение родительской #.

6) В оптимальных условиях происходит прорастание споры. Сначала она активно поглощает воду и набухает, усиливается дыхание, возрастает активность ферментов, происходит выделение АК – активация метаболизма (в этот период спора УТРАЧИВАЕТ ТЕРМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ). Затем спора лопается и из неё выходит вегетативная форма.