Для адекватного и эффективного лечения многих инфекционных заболеваний необходимо своевременное установление точного диагноза. В решении этой задачи в наши дни привлекаются высокотехнологичные методы диагностики основанные на методах молекулярной биологии. В настоящий момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) уже достаточно широко применяется в практической медицине как наиболее надежный инструмент лабораторной диагностики .

Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?

Во-первых, данный метод используется для выявления возбудителей различных инфекционных заболеваний с высокой точностью.

Во-вторых, для контроля эффективности проведенного лечения.

В различных руководствах, проспектах, статьях, а также объяснениях врачей-специалистов, мы часто сталкиваемся с употреблением непонятных терминов и слов. Действительно трудно рассказать о высокотехнологичных продуктах науки обыденными словами.

В чем суть и механика ПЦР диагностики?

Каждый живой организм имеет свои уникальные гены. Гены располагаются в молекуле ДНК, которая собственно и является «визитной карточкой» каждого конкретного организма. ДНК (генетический материал) – это очень длинная молекула, которая состоит из «кирпичиков», называемых нуклеотидами. У каждого возбудителя инфекционных заболеваний они расположены строго специфично, то есть в определенной последовательности и комбинации. Когда необходимо понять имеется ли у человека тот или иной возбудитель, забирается биологический материал (кровь, моча, слюна, мазок), который содержит ДНК или фрагменты ДНК микроба. Но количество генетического материала возбудителя очень мало, и невозможно сказать какому именно микроорганизму он принадлежат. Для решения этой задачи и служит ПЦР. Суть полимеразной цепной реакции заключается в том, что берется малое количество материала для исследования, содержащего ДНК, а в процессе ПЦР происходит увеличение количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю и, таким образом, его можно идентифицировать.

ПЦР диагностика – генетическое исследование биоматериала.

Идея метода ПЦР принадлежит американскому ученому K.Mullins, которую он предложил в 1983 году. Однако широкое клиническое применение получила лишь в средине 90-х годов XXвека.

Разберемся с терминологией, что же это такое – ДНК и т.д. Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа.

Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. ДНК – химически это дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из структурных компонентов – нуклеотидов. Нуклеотидов бывает 5 видов – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, ген, кодирующий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

Нуклеотиды имеют свойство комплементарности. Это означает что напротив аденина (А) в одной цепочке ДНК обязательно стоит тимин (Т) в другой цепочке, а напротив гуанина (Г) – цитозин (Ц). Схематически выглядит следующим образом:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Данное свойство комплементарности ключевое для проведения ПЦР.

Помимо ДНК такую же структуру имеет РНК – рибонуклеиновая кислота, отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил. РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами (например, ВИЧ).

Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться» (данное свойство используется для проведения ПЦР). Происходит это следующим образом: две нити ДНК или РНК, отходят друг от друга в стороны, на каждую нить садится специальный фермент, который синтезирует новую цепочку. Синтез идет по принципу комплементарности, то есть, если в исходной цепочке ДНК стоит нуклеотид А, то во вновь синтезированной будет стоять Т, если Г – то Ц и т.д. Этот специальный фермент -«строитель» для начала синтеза нуждается в «затравке» - последовательности из 5-15 нуклеотидов. Данная «затравка» определена для каждого гена (гена хламидии , микоплазмы , вирусов) экспериментально.

Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем». В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.

Этапы проведения ПЦР исследования

Забор биологического материала для исследования

В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию.

В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат – термоциклер (амплификатор). В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов (денатурация, отжиг и удлинение). Что это означает? Рассмотрим подробнее.

Этапы непостредственно ПЦР реакции, копирование генетического материала

I этап ПЦР - Подготовка генетического материала для копирования.
Происходит при температуре 95° С, при этом нити ДНК разъединяются, и на них могут садиться «затравки».

«Затравки» изготавливают промышленным способом различные научно-производственные объединения, а лаборатории покупают уже готовые. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т.д. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра.

II этап – Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».
Если имеется ДНК определяемого вируса или бактерии , «затравка» садится на эту ДНК. Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. Данная стадия проходит при температуре 75°С.

III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции.
Это процесс собственно удлинения или размножения генетического материала, который происходит при 72°С. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. С окончанием синтеза новой цепочки ДНК, заканчивается и цикл ПЦР. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Например, в исходной пробе имелось 100 молекул ДНК какого-либо вируса, после первого цикла ПЦР в пробе будет уже 200 молекул ДНК тестируемого вируса. Один цикл длится 2-3 минуты.

Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа.

Этап идентификации размноженного генетического материала

Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа (то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т.д.). При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген (краситель), вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе.

На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%. Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий:

1. корректный забор, транспортировка биологического материала;
2. наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала;
3. строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа

Чувствительность различается для различных выявляемых микробов. Так, например, чувствительность метода ПЦР для выявления вируса гепатита С составляет 97-98%, чувствительность для выявления уреаплазмы – 99-100%.

Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного.
Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний. Учитывая продолжительность выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущество метода ПЦР становится очевидным.

ПЦР в диагностике инфекций
Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине.
Основные области применения ПЦР-диагностики:

1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
2. контроль эффективности проведенной терапии
3. уточнение вида возбудителя

ПЦР используется в акушерстве, гинекологии, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, клинике инфекционных болезней, офтальмологии, неврологии, фтизиопульмонологии и др.

Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Их сочетание и целесообразность определяет лечащий врач.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2
2. герпетиформные вирусы
3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод биохимической технологии в молекулярной биологии, проводящийся с целью увеличения одной или нескольких копий фрагментов ДНК на несколько степеней, что позволяет создать от нескольких тысяч до миллионов копий определенной последовательности ДНК.

Разработанный в 1983 году Кэри Муллисом, метод ПЦР в настоящее время является распространенным и зачастую незаменимым методом, использующимся в медицинских и биологических исследовательских лабораториях для множества различных приложений. Они включают клонирование ДНК для секвенирования, филогению на основе ДНК, или функциональный анализ генов; диагностику наследственных заболеваний; выявление генетических отпечатков пальцев (используется в отраслях судебной медицины и в проведении теста на отцовство), а также выявление и диагностику инфекционных заболеваний. В 1993 году, Муллис был удостоен Нобелевской премии по химии вместе с Майклом Смитом по их работе над ПЦР .

Метод основан на термоциклировании, состоящем из повторяющихся циклов нагрева и охлаждения реакции для денатурации и репликации ДНК ферментами. Праймеры, (короткие фрагменты ДНК), содержащие последовательности, комплементарные с целевым участком наряду с ДНК-полимеразой (на основе чего метод получил название), являются ключевыми компонентами для запуска избирательной и повторной амплификации. В процессе ПЦР, сама синтезированная ДНК используется в качестве матрицы для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой ДНК-матрица амплифицируется в геометрической прогрессии. ПЦР может значительно модифицироваться для выполнения широкого спектра генетических манипуляций.

Почти все ПЦР-приложения используют термостабильную ДНК-полимеразу, такую как Taq-полимераза, фермент , первоначально выделенный из бактерии Thermus aquaticus . Эта ДНК-полимераза ферментативно собирает новую цепь ДНК из блоков, составляющих ДНК - нуклеотидов, используя одноцепочечную ДНК в качестве матрицы и олигонуклеотиды ДНК (также называемые праймерами ДНК), которые необходимы для инициации синтеза ДНК. Подавляющее большинство методов ПЦР применяют термоциклирование, т. е. попеременное нагревание и охлаждение образца ПЦР по определенному ряду температурных этапов. Эти этапы термоциклирования необходимы сначала для физического разделения двух цепей двойной спирали ДНК при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией ДНК. При более низкой температуре, каждая цепь будет использоваться в качестве матрицы в синтезе ДНК ДНК-полимеразой для того, чтобы избирательно амплифицировать целевой участок ДНК. Избирательность результатов ПЦР с использованием праймеров, которые являются комплементарными с участком ДНК - мишенью для амплификации при определенных условиях термоциклирования.

Принципы ПЦР диагностики

ПЦР используется для амплификации определенного участка цепи ДНК (ДНК-мишень). Большинство методов ПЦР обычно амлифицируют фрагменты ДНК до ~ 10000 пар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют увеличивать фрагменты до 40 кб в размере. Реакция производит ограниченное количество конечного амплифицированного продукта, который регулируется имеющимися реактивами в реакции и обратной связью-ингибированием продуктов реакции.

Основной набор ПЦР требует нескольких компонентов и реактивов. Они включают:

• ДНК-матрицу , содержащую целевой участок ДНК, который требуется амплифицировать.
• Два праймера, комплементарные 3"-концам каждой из смысловой и антисмысловой цепей ДНК-мишени.
• Taq-полимераза или иная ДНК-полимераза, действующая при оптимальной температуре около 70 ° C.
• Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ; трифосфатные группы, содержащие нуклеотиды), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК.
• Буферный раствор , обеспечивающий подходящие химические условия для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы.
• Двухвалентные катионы, ионы магния или марганца; обычно используется Mg2 +, но также может использоваться и Mn2 + для ПЦР-опосредованного мутагенеза ДНК, так как более высокие концентрации Mn2 + увеличивают частоту ошибок в процессе синтеза ДНК.
• Одновалентные катионы ионов калия.

ПЦР обычно проводится в реакционном объеме 10-200 мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0.2-0.5 мл) в термоциклере-амплификаторе. Амплификатор нагревает и охлаждает реакционные пробирки для достижения температур, необходимых на каждом этапе реакции. Многие современные амплификаторы используют эффект Пельтье, который позволяет нагревать и охлаждать блок с ПЦР-пробирками просто путем изменения направления электрического тока. Тонкостенные реакционные пробирки способствуют благоприятной теплопроводности для обеспечения быстрого теплового равновесия. Старые амплификаторы, у которых отсутствует нагреваемая крышка, требуют слоя масла на поверхности реакционной смеси или шарика воска в пробирке.

Порядок процедуры

Как правило, ПЦР состоит из серий 20-40 повторяющихся изменений температуры, называемых циклами, причем каждый цикл обычно состоит 2-3 дискретных температурных этапов, обычно трех. Циклирование зачастую начинается и завершается одним температурным этапом (так называемым ожиданием ) при высокой температуре (> 90 ° C) для окончательного расширения продукта или краткого хранения. Использующиеся температуры и длительность времени их применения в каждом цикле зависит от множества параметров. Они включают в себя фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и дНТФ в реакции, и температуру плавления (Tm) праймеров.

• Этап инициализации: Этот этап состоит из нагрева реакции до температуры 94-96 ° C (или 98 ° C, если используются высоко термостабильные полимеразы), который проводится на 1-9 минут. Этап требуется только для ДНК-полимераз, которым необходима активация теплом, так называемым горячим стартом ПЦР.
• Этап денатурации: Является первым регулярным событием термоциклирования и состоит из нагревания реакции до 94-98°C в течение 20-30 секунд. Это вызывает расщепление ДНК-матрицы с разрушением водородных связей между комплементарными основаниями и образованием одноцепочечных молекул ДНК.
• Этап отжига: Температура реакции снижается до 50-65°С в течение 20-40 секунд, что позволяет праймерам связаться с одноцепочечной матрицей ДНК. Обычно температура отжига составляет около 3-5 градусов по Цельсию ниже Tm используемых праймеров. Стабильные водородные связи ДНК-ДНК формируются только, когда последовательность праймера точнее соответствует матрице последовательности. Полимераза связывается с гибридом «праймер-матрица» и начинает синтез ДНК.
• Этап расширения / элонгации: Температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; Taq-полимераза имеет свою оптимальную температуру активности при 75-80°C; обычно используется температура 72°C для этого фермента. На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы, добавляя дНТФ, которые являются комплементарными матрице в направлении 5 "к 3", связывая 5"-фосфатную группу дНТФ с 3"-гидроксильной группой в конце образующейся (расширяющейся) ДНК. Время расширения зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и длины фрагмента ДНК, который необходимо амплифицировать. Как правило, при своей оптимальной температуре, ДНК-полимераза полимеризует тысячу оснований в минуту. При оптимальных условиях, т.е. при отсутствии ограничений вследствие ограничивающих субстратов или реактивов, на каждом этапе расширения, количество ДНК-мишени удваивается, что приводит к экспоненциальной (в геометрической прогрессии) амплификации фрагмента ДНК.
• Финальное удлинение: Это единственный этап, выполняющийся иногда при температуре 70-74°С в течение 5-15 минут после последнего цикла ПЦР для того, чтобы убедиться, что любые оставшиеся одноцепочечные ДНК удлинились полностью.
• Финальное ожидание: Этот этап при температуре 4-15 ° C в течение неопределенного времени может быть использован для кратковременного сохранения реакции. Чтобы проверить, синтезировала ли ПЦР ожидаемый фрагмент ДНК (также иногда называют «амплимер» или «ампликон»), применяется электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов ПЦР по размеру. Размер ПЦР-продуктов определяется путем сравнения с лестницей ДНК (маркером молекулярного веса), которая содержит фрагменты ДНК известного размера, выполняется на геле наряду с ПЦР-продуктами.

Стадии полимеразной цепной реакции

Процесс ПЦР можно разделить на три этапа:

1. Экспоненциальная амплификация : В течение каждого цикла, количество продукта удваивается (при условии 100% эффективности реакции). Реакция очень чувствительна: необходимо присутствие только незначительного количества ДНК.
2. Стадия выравнивания : реакция замедляется, так как ДНК-полимераза теряет активность и потребление реактивов, таких как дНТФ и праймеры, заставляет их стать ограничивающими.
3. Плато : Продукт больше не накапливается из-за истощения реактивов и ферментов.

Оптимизация ПЦР

На практике, ПЦР может пройти не успешно по различным причинам, в частности из-за ее чувствительности к загрязнению, что вызывает амплификацию побочных продуктов ДНК. В связи с этим, был разработан ряд методик и процедур для оптимизации условий ПЦР. Загрязнением посторонней ДНК занимаются лабораторные протоколы и процедуры, которые очищают предварительно ПЦР-смеси от потенциальных ДНК-загрязнителей. Это обычно включает пространственное разделение ПЦР-комплектов от областей для анализа или очистки продуктов ПЦР, использование одноразовой пластиковой посуды и тщательную очистку рабочей поверхности между этапами проведения реакции. Методы конструирования праймеров играют важную роль в улучшении выделения продуктов ПЦР и в избегании образования побочных продуктов, а также использование альтернативных компонентов буфера или полимеразных ферментов может помочь в амплификации длинных или иначе проблемных участков ДНК. Добавление реактивов, таких как формамид, в буферные системы может увеличить специфичность и выделение ПЦР. Симуляция на компьютере теоретических результатов ПЦР (электронная ПЦР) может быть выполнена для оказания помощи в конструировании праймеров.

Применение ПЦР

Селективное выделение ДНК

ПЦР позволяет выделять фрагменты ДНК из геномной ДНК с помощью селективной амплификации конкретного участка ДНК. Это применение ПЦР дополняет многие методы, такие как создание зондов гибридизации для методов «саузерн» или «норзерн-блоттинга» и клонирования ДНК, которые требуют больших количеств ДНК, представляющих собой специфический участок ДНК. ПЦР снабжает эти методы высоким содержанием чистой ДНК, что позволяет выполнить анализ образцов ДНК, даже с небольшим количеством исходного материала.

Другие применения ПЦР включают секвенирование ДНК с целью определения неизвестных ПЦР-амплифицированных последовательностей, в которой один из апмлификационных праймеров может быть использован в секвенировании по Сэнгеру, выделении последовательности ДНК для ускорения технологий рекомбинантной ДНК, включающих вставку последовательности ДНК в плазмиду или генетический материал другого организма. Можно быстро провести скрининг колоний бактерий (кишечной палочки) посредством ПЦР для коррекции конструкции векторной ДНК. ПЦР также можно применять для генетической дактилоскопии; методика, используемая в судебной медицине для идентификации личности или организма путем сравнения экспериментальных ДНК с помощью различных ПЦР - методов.

Некоторые методы ПЦР «отпечатков пальцев» имеют высокую дискриминационную силу и могут использоваться для определения генетических связей между людьми, такими как родитель -ребенок или между братьями и сестрами, и используются в выявлении отцовства. Эта методика также может применяться для определения эволюционных взаимоотношений между организмами.

Амплификация и количественная оценка ДНК

Так как ПЦР увеличивает число копий участков ДНК, которые являются мишенями, ПЦР может применяться для анализа очень малых количеств образца. Зачастую это имеет решающее значение для судебно-медицинской экспертизы, когда доступны только следовые количества ДНК в качестве доказательств. ПЦР также может применяться при анализе древних ДНК, которым десятки тысяч лет. Эти ПЦР-методы были успешно использованы на животных, таких как сорокатысячелетний мамонт, а также на ДНК человека, в приложениях, начиная от анализа египетских мумий до идентификации русского царя.

Количественные методы ПЦР позволяют оценить количество заданной последовательности, присутствующей в образце - метод часто применяется для количественного определения уровня экспрессии гена. ПЦР в реальном времени является признанным инструментом для количественного анализа ДНК, который измеряет накопление ДНК продукта после каждого цикла ПЦР-амплификации.

ПЦР в диагностике заболеваний

ПЦР позволяет провести раннюю диагностику злокачественных заболеваний, таких как лейкемия и лимфома, которая в настоящее время является высоко развитой в исследованиях рака и уже используется в плановом порядке. ПЦР может проводиться непосредственно на геномных образцах ДНК для выявления транслокационно-специфичных злокачественных клеток с чувствительностью, которая, по крайней мере, в 10 000 раз выше, чем у других методов.

ПЦР позволяет также выявлять некультивируемые или медленно растущие микроорганизмы, таких как микобактерии, анаэробные бактерии, и вирусы из культуры ткани и моделей животных. Основанием для ПЦР диагностических приложений в области микробиологии является выявление инфекционных агентов и дифференцировка непатогенных штаммов от патогенных в силу специфических генов.

Вирусная ДНК может также выявляться с помощью ПЦР. Праймеры должны быть специфичными к целевым последовательностям ДНК вируса, и ПЦР может применяться для диагностических анализов ДНК или секвенирования генома вируса. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаружить вирусы вскоре после инфицирования и даже до начала заболевания. Такое раннее выявление вируса может дать врачам значительные возможности в лечении. Количество вируса («вирусная нагрузка») у пациента также может быть определено количественными методом анализа ДНК на основе ПЦР.

Вариации основных методов полимеразной цепной реакции

• Аллель-специфичная ПЦР : метод диагностики или клонирования, основанный на однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) (отличиях одного основания в ДНК). Требует предварительных знаний о последовательности ДНК, включая различия между аллелями, и использует праймеры, чьи 3"-концы охватывают SNP. ПЦР-амплификация в жестких условиях гораздо менее эффективна в присутствии несоответствия между матрицей и праймером, поэтому успешная амплификация с SNP-специфическим праймером сигнализирует о наличии специфических SNP в последовательности.
• ПЦР-сборка или сборка циклирования полимеразы (СЦП): искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем проведения ПЦР на резерве длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуются между направлениями смысловой и антисмысловой цепей, и перекрывающиеся сегменты определяют порядок ПЦР-фрагментов, тем самым селективно вырабатывая окончательный длинный продукт ДНК.
• Асимметричная ПЦР : преимущественно амплифицирует одну цепь ДНК в матрице двухцепочечной ДНК. Используется в секвенировании и гибридизационного зондирования, где требуется амплификация только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводится как обычно, но с большим избытком праймеров для цепи, предназначенной для амплификации. Из-за медленной (в арифметической прогрессии) амплификации в конце реакции после использования ограничивающего праймера, требуются дополнительные циклы ПЦР. Последняя модификация этого процесса, известная как «LATE-PCR» (линейность после экспоненциальной фазы - ПЦР) использует ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления (Tm), чем избыток праймера для поддержания эффективности реакции, так как концентрация ограничивающего праймера снижается в середине реакции.
• Dial-out ПЦР : высоко параллельный метод с целью получения точных молекул ДНК для синтеза генов. Комплексный резерв молекул ДНК модифицируется уникальными фланговыми метками до массивного параллельного секвенирования. Tag-направленные праймеры затем обеспечивают получение молекул с заданной последовательностью с помощью ПЦР.
• Геликаза-зависимая амплификация: аналогична традиционной ПЦР, но требует постоянную температуру, чем циклирование через циклы денатурации и отжига / расширения. Геликаза ДНК, фермент, который раскручивает ДНК, используется вместо тепловой денатурации.
• Горячий старт ПЦР : методика, которая снижает неспецифическую амплификацию во время начальной настройки этапов ПЦР. Может выполняться вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры денатурации (например, 95 ° C) перед добавлением полимеразы. Были разработаны системы специализированных ферментов, которые ингибируют активность полимеразы при комнатной температуре, либо путем связывания антител, либо в присутствии ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируются только после высокотемпературной стадии активации. «Горячий старт/холодный финиш» ПЦР достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые являются неактивными при температуре окружающей среды и мгновенно активируются при температуре элонгации.
• ПЦР, специфичная к межмикросателлитным последовательностям (ISSR): ПЦР-метод ДНК-дактилоскопии, который увеличивает число копий участков между простыми повторяющимися последовательностями для получения уникального отпечатка из амплифицированной длины фрагмента.
• Инвертированная ПЦР широко используется для определения участков последовательности вокруг геномных вставок. Она включает ряд расщеплений ДНК и самостоятельного лигирования, в результате чего образуются известные последовательности на любом конце неизвестной последовательности.
• ПЦР, опосредованная лигированием: Использует небольшие линкеры ДНК, соединенные с интересующей ДНК и несколькими праймерами, связанные с линкерами ДНК; используется для секвенирования ДНК, метода прогулки по геному, и футпринтинга ДНК.
• Метилирование-специфическая ПЦР (MSP): разработана Стивеном Бэйлином и Джимом Германом в Школе Медицины Джона Хопкинса, используется для обнаружения метилирования островков CpG в геномной ДНК. ДНК сначала обрабатывается бисульфитом натрия, который преобразует неметилированные основания цитозина в урацил, распознающийся ПЦР-праймерами как тимин. Затем проводятся две ПЦР на модифицированной ДНК с использованием наборов идентичных праймеров, за исключением в любом островке CpG в пределах последовательности праймеров. В этих точках, один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для увеличения числа копий метилированной ДНК, и один набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также может выполняться с целью получения количественной, нежели качественной информации о метилировании.
• Минипраймер - ПЦР: используются термостабильные полимеразы (S-Tbr), которые могут расширять от коротких праймеров («smalligos»), с числом от 9 или 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет ПЦР нацеливаться на регионы, связанные с меньшими праймерами, и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как ген рРНК 16S (или эукариотическая 18S).
• Амплификация зонда, зависящего от мультиплексного лигирования (MLPA ): позволяет амплифицировать множество мишеней только с одной парой праймеров, таким образом, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР.
• Мультиплексная ПЦР состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР с целью получения ампликонов разных размеров, которые специфичны к различным последовательностям ДНК. По ориентации на несколько генов одновременно, возможно получить дополнительную информацию при проведении одного теста, что в противном случае потребовало бы больше в несколько раз реагентов и больше времени для выполнения. Температуры отжига для каждого набора праймеров должны быть оптимизированы, чтобы работать правильно в пределах одной реакции, и с размерами ампликона. То есть, длина их пары оснований должна быть достаточно разной с целью образования отдельных полос при визуализации путем электрофореза в геле.
• Вложенная ПЦР : увеличивает специфичность амплификации ДНК, за счет уменьшения фона в связи с неспецифической амплификацией ДНК. Используются два набора праймеров в двух последовательных ПЦР. В первой реакции одна пара праймеров используется для синтеза ДНК-продуктов, которые помимо намеченной цели, могут по-прежнему состоять из неспецифически амплифицированных фрагментов ДНК. Продукты используются затем во второй ПЦР с набором праймеров, чьи сайты связывания полностью или частично отличаются от 3"-концов каждого из праймеров, использованных в первой реакции. Вложенная ПЦР часто наиболее успешна в специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем традиционная ПЦР, но она требует более подробных знаний о последовательностях-мишенях.
• ПЦР с перекрывающимися расширениями или сращивание перекрывающимися расширениями (SOE): методика генной инженерии, которая применяется для соединения двух или более фрагментов ДНК, которые содержат комплементарные последовательности. Используется для соединения частей ДНК, содержащие гены, регулирующие последовательности, или мутации; техника позволяет создавать специфические и длинные конструкции ДНК.
• Количественная ПЦР (КПЦР): используется для измерения количества продукта ПЦР (обычно в режиме реального времени). Количественно измеряет начальные количества ДНК, кДНК или РНК. КПЦР широко применяется для определения наличия последовательности ДНК в образце, и числа ее копий в пробе. Количественная ПЦР в реальном времени имеет очень высокую степень точности. Методы QRT-PCR (или QF-PCR) используют флуоресцентные красители, такие как «Sybr Green», «EvaGreen» или флюорофор-содержащие ДНК-зонды, такие как «TaqMan», чтобы измерить количество амплифицированного продукта в реальном времени. Иногда упоминается под сокращением RT-PCR (ПЦР в реальном времени) или RQ-PCR. QRT-PCR или RTQ-PCR являются более подходящими сокращениями, так как RT-PCR обычно относится к ПЦР с обратной транскрипцией, часто используемой в сочетании с КПЦР.
• ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR): для увеличения числа копий ДНК из РНК. Обратная транскриптаза транскрибирует РНК в кДНК, которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. RT-PCR широко используется в профилировании экспрессии для выявления экспрессии гена или для определения последовательности РНК-транскрипта, включая сайты старта транскрипции и прекращения. Если известна геномная последовательность ДНК гена, RT-PCR может использоваться для отображения расположения экзонов и интронов в гене. 5"-конец гена (соответствующий сайту старта транскрипции), как правило, определяется RACE-PCR (быстрой амплификацией концов кДНК).
• ПЦР твердой фазы : охватывает несколько значений, в том числе «Амплификация Полонии» (где ПЦР колонии производятся на матрице геля, например), «Bridge ПЦР» (праймеры ковалентно связаны с твердой опорной поверхностью), традиционная ПЦР твердой фазы (где применяется «асимметричная ПЦР» в присутствии праймеров, несущих твердую опору с последовательностью, соответствующей одному из водных праймеров), и ПЦР усиленной твердой фазы (где традиционная ПЦР твердой фазы может быть улучшена за счет применения высоких Tm и вложенных праймеров с твердой опорой с вариантом приложения термического «этапа», чтобы способствовать образованию праймеров с твердой опорой).
• Термическая асимметричная чередующаяся ПЦР (TAIL-PCR): применяется с целью выделения неизвестной последовательности, следующей за известной последовательностью. В известной последовательности, TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с различными температурами отжига; дегенерат праймера используется для амплификации в другом направлении от неизвестной последовательности.
• Touchdown PCR (ступенчатая ПЦР): вариант ПЦР, направленный на уменьшение неспецифического фона путем постепенного снижения температуры отжига по мере прогрессирования циклов ПЦР. Температура отжига на начальных циклах, как правило, на несколько градусов (3-5 ° C) выше Tm используемых праймеров, в то время как на более поздних циклах, температура на несколько градусов (3-5 ° C) ниже Tm праймеров. Более высокие температуры дают большую специфичность для связывания праймера, и более низкие температуры способствуют более эффективной амплификации из специфических продуктов, образующихся во время начальных циклов.
• PAN-AC : использует изотермические условия для амплификации и может применяться на живых клетках.
• Универсальная быстрая прогулка по геному : для прогулки по геному и генетической дактилоскопии с использованием более специфических «двусторонних» ПЦР, чем традиционные "односторонние" подходы (с использованием только один ген-специфического праймера и одного общего праймера - что может привести к артефактному «шуму») в силу механизма, включающего образование структуры лассо. Упрощенными производными UFW являются «Lane RAGE» (лассо-зависимая вложенная ПЦР для быстрой амплификации концов геномной ДНК), «5"RACE Lane» и «3"RACE Lane».
• In silico PCR (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) относится к вычислительным средствам, применяющимся для вычисления результатов теоретической полимеразной цепной реакции с помощью данного набора праймеров (зондов) для амплификации последовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома.

История ПЦР

В статье в «Journal of Molecular Biology» в 1971 г. Клеппе и его соавторов впервые описан метод с использованием ферментативного анализа с целью репликации короткой матрицы ДНК с праймерами в условиях пробирки. Тем не менее, это раннее проявление основного принципа ПЦР не получило много внимания, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году, как правило, приписывается Кэри Муллису.

Когда Муллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле, Калифорнии на «Cetus Corporation», одной из первых компаний биотехнологии. Там он отвечал за синтез коротких цепочек ДНК. Муллис писал, что он задумал ПЦР во время езды вдоль шоссе Пасифик Кост однажды ночью в своем автомобиле. Он проигрывал в своем сознании новый способ анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда он осознал, что он вместо этого изобрел метод увеличения числа копий любого участка ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации, обусловленной ДНК-полимеразой. В «Scientific American», Муллис резюмировал процедуру: «Начиная с одной молекулы генетического материала ДНК, ПЦР может генерировать 100 млрд. подобных молекул за один день. Эту реакцию легко выполнить. Она требует не больше, чем пробирку, несколько простых реагентов и источник тепла». Он был награжден Нобелевской премией по химии в 1993 году за свое изобретение, семь лет спустя как он и его коллеги в «Cetus» впервые осуществили его предложение на практике. Тем не менее, остались некоторые противоречия об интеллектуальном и практическом вкладе других ученых в работе Муллиса, и был ли он единственным изобретателем принципа ПЦР.

В основе метода ПЦР лежит использование подходящей ДНК-полимеразы, способной выдерживать высокие температуры> 90°C (194°F), необходимых для расщепления двух цепей ДНК в двойной спирали ДНК после каждого цикла репликации. ДНК-полимеразы, первоначально использовавшиеся для экспериментов в пробирке, предвещая ПЦР, были не в состоянии выдержать такие высокие температуры. Поэтому, ранние процедуры репликации ДНК были очень неэффективны и занимали много времени, а также требовали большого количества ДНК-полимеразы и непрерывной обработки в течение всего процесса.

Открытие в 1976 г. Taq-полимеразы - полимеразы ДНК, выделенной из термофильной бактерии, Thermus aquaticus , которая, естественно, живет в горячих (от 50 до 80°C (122 до 176°F)) средах, таких как горячие источники - проложило путь к кардинальному улучшению метода ПЦР. ДНК-полимераза, выделенная из Т. Aquaticus , стабильна при высоких температурах и остается активной даже после денатурации ДНК, тем самым устраняя необходимость добавления новых ДНК-полимераз после каждого цикла. Это позволило автоматизировать процесс амплификации ДНК на основе амплификатора-термоциклера.

Патентные войны

Предложенный метод ПЦР был запатентован Кэри Муллисом и приписан «Cetus Corporation», где работал Муллис, когда он изобрел методику в 1983 году. Фермент Taq-полимераза был также защищен патентами. Было подано несколько громких исков, связанных с методикой, в том числе безуспешный иск, поданный «DuPont». Фармацевтическая компания «Hoffmann-La Roche» приобрела права на патенты в 1992 году и в настоящее время держит те, которые по-прежнему защищены.

Подобное патентное сражение за фермент Taq-полимеразу все еще продолжается в некоторых юрисдикциях по всему миру между «Roche» и «Promega». Правовые аргументы вышли за рамки сроков действия исходных патентов на ПЦР и Taq-полимеразу, срок действия которых истек 28 марта 2005 года.

Который позволяет обнаружить в биологическом материале малые количества точнее, определенных ее фрагментов, и размножить их во много раз. Затем их идентифицируют визуально путем электрофореза в геле. Реакция была разработана в 1983 г. К. Муллисом и включена в список выдающихся открытий последних лет.

Каковы механизмы ПЦР

Вся методика базируется на способности нуклеиновых кислот к самостоятельной репликации, что в данном случае проводится искусственно в условиях лаборатории. Воспроизведение ДНК может начаться не в любой области молекулы, а только в участках с определенной последовательностью нуклеотидов — стартовых фрагментах. Для того чтобы полимеразная цепная реакция началась, нужны праймеры (или ДНК-зонды). Это короткие фрагменты цепочки ДНК с заданной нуклеотидной последовательностью. Они комплементарные (то есть соответствующие) стартовым участкам

Разумеется, чтобы создать праймеры, ученые должны изучить последовательность нуклеотидов той которая участвует в методике. Именно эти ДНК-зонды обеспечивают специфичность реакции и ее инициацию. не пойдет, если в образце не найдется хотя бы одна молекула искомой ДНК. В целом, для проведения реакции необходимы вышеуказанные праймеры, набор нуклеотидов, термоустойчивая ДНК-полимераза. Последняя является ферментом — катализатором реакции синтеза новых молекул нуклеиновой кислоты на основе образца. Все эти вещества, включая биологический материал, в котором необходимо выявить ДНК, объединяются в реакционную смесь (раствор). Она помещается в специальный термостат, выполняющий ее очень быстрое нагревание и охлаждение за заданное время — цикл. Обычно их 30-50.

Как проходит эта реакция

Сущность ее в том, что во время одного цикла праймеры присоединяются к нужным участкам ДНК, после чего идет ее удвоение под действием фермента. На основе получившихся нитей ДНК в последующих циклах синтезируются новые и новые идентичные фрагменты молекулы.

Полимеразно-цепная реакция идет последовательно, выделяют следующие ее стадии. Первая характеризуется удваиванием количества продукта в течение каждого цикла нагревания и охлаждения. На второй стадии происходит замедление реакции, поскольку фермент повреждается, а также теряет активность. Помимо этого, истощаются запасы нуклеотидов и праймеров. На последней стадии — плато — продукты более не накапливаются, поскольку реактивы закончились.

Где ее применяют

Несомненно, широчайшее применение полимеразная цепная реакция находит в медицине и науке. Ее используют в общей и частной биологии, ветеринарной медицине, фармации и даже экологии. Притом в последней это делают для отслеживания качества продуктов питания и объектов внешней среды. Активно применяется полимеразная цепная реакция в криминалистической практике для подтверждения отцовства и идентификации личности человека. В судебно-медицинской экспертизе, так же, как и в палеонтологии, часто эта методика является единственным выходом, так как обычно для исследования доступно крайне малое количество ДНК. Безусловно, очень широкое применение метод нашел в практической медицине. Он необходим в таких ее областях, как генетика, инфекционные и онкологические заболевания.

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

1. Выделение ДНК
2. Амплификация ДНК-фрагментов
3. Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5-2 часа.

0Array ( => Анализы) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256... С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

5360 руб.Стоимость комплексной программы у врача гастроэнтеролога

СКИДКА 25%НА ПРИЕМ ВРАЧА КАРДИОЛОГА

- 25%первичный
приём врача
терапевта по выходным

5 160 руб.вместо 5 420 руб. Обследование мужчин на урологические инфекции

АЛЛЕРГОЛОГИЯ5 120 руб. вместо 5 590 руб.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

Важное значение в ПЦР-диагностике играет квалификация врача-лаборанта, проводящего анализ, от него зависит правильность настройки ПЦР-оборудования и интерпретация полученных результатов. Врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» имеют большой опыт в проведении ДНК-диагностики, что обеспечивает достоверность полученных результатов исследования и гарантирует положительный успех в лечении инфекционных заболеваний. Чтобы сдать анализы методом ПЦР и провести полную диагностику и лечение инфекционных заболеваний в нашем медицинском центре «Евромедпрестиж».

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2. Принцип метода полимеразной цепной реакции

2.1 Наличие в реакционной смеси ряда компонентов

2.2 Циклический температурный режим

2.3 Основные принципы подбора праймеров

2.4 Эффект "плато"

3. Cтадии постановки ПЦР

3.2 Амплификация

3.4.1 Положительные контроли

3.4.2 Внутренние контроли

4.1 Качественный анализ

4.1.2 Детекция молекул РНК

3.1 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

3.2 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

3.3 Оценка результатов реакции

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

3.3.1 Метод горизонтального электрофореза

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 - 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Однако это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.

3.3.2 Метод вертикального электрофореза

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламидные гели. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в обычной работе используют метод горизонтального электрофореза.

3.4 Контроль за прохождением реакции амплификации

3.4.1 Положительные контроли

В качестве "положительного контроля" используют препарат ДНК искомого микроорганизма. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Размер неспецифических продуктов может быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды (участки ДНК, расположенные внутри амплифицируемой последовательности), меченные ферментными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры. Это значительно усложняет и удлиняет анализ, а его стоимость существенно увеличивается.

3.4.2 Внутренние контроли

Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели используют дополнительный, так называемый "внутренний контроль". Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.

К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контролем за праймеры. Это особенно принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам.

Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры, этот способ контроля эффективности амплификации безусловно будет весьма полезен.

4. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

4.1 Качественный анализ

Классический способ постановки ПЦР, принципы которого были изложены выше, нашел свое развитие в некоторых модификациях, направленных на преодоление ограничений ПЦР и повышение эффективности прохождения реакции.

4.1.1 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"

Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Дело в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.

Существуют различные варианты реализации "горячего старта":

Внесение в реакционную смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после прогрева пробирки до температуры денатурации.

Разделение ингредиентов реакционной смеси парафиновой прослойкой на слои (в нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются при расплавлении парафина (~65-75 0 С).

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных случаях, даже если неспецифический отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

4.1.2 Детекция молекул РНК

Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК. При этом в их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза превращения в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют обратную транскриптазу, которую выделяют из двух различных вирусов: avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Использование этих ферментов связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны и поэтому могут быть использованы при температуре не выше 42° С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Предпринимаются попытки обойти этот недостаток используя в качестве обратной транскриптазы термостабильную полимеразу, полученную из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Mn 2+ . Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси также как и в ПЦР должны присутствовать праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ, как строительный материал.

После проведения реакции обратной транскрипции полученные молекулы кДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

5. Организация технологического процесса постановки ПЦР

Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода - контаминацией.

Контаминация - попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты.

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на урацил, и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Таким образом, этот метод лишь в некоторой степени позволяет устранить источник контаминации и не гарантирует от ложноположительных результатов.

Другой способ борьбы с результатами контаминации, значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных результатов велик, т.к и в этом случае при отсутствии ингибиторов легко получить продукт амплификации из-за контаминации.

Таким образом, несмотря на пользу преамплификационных мероприятий, направленных на инактивацию молекул ДНК, служащих причиной возникновения ложноположительных результатов, наиболее радикальным средством является заранее продуманная организация лаборатории.

Заключение

Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в ранней диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.