Кишечная палочка (эшерихии) в организме человека в норме заселяет весь пищеварительный канал. Выделяют различные штаммы (виды) кишечной палочки, которые выполняют полезные функции в организме. Однако некоторые агрессивные разновидности могут вызвать заболевание у детей и взрослых.

Кишечную палочку (эшерихию) новорожденный получает с молоком матери и при непосредственном контакте с окружающими людьми в первые сутки от момента рождения. На протяжении всей жизни определенные штаммы кишечной палочки постоянно присутствуют на поверхности слизистой кишечника, выполняя определенные полезные функции. Это так называемые комменсалы – обязательные представители собственной .

При нарушении гигиенических моментов в организм человека проникают патогенные виды кишечной палочки, которые вызывают симптом различных заболеваний.

Непатогенные кишечные палочки

Эшерихии в пищеварительном канале выполняют определенные функции:

• препятствуют заселению слизистой ЖКТ (микробный антагонизм);
• участвуют в синтезе витаминов группы В и К;
• обеспечивают процессы расщепления, всасывания и переваривания некоторых пищеварительных веществ.

Большое значение играет не только факт присутствия непатогенных штаммов кишечной палочки внутри пищеварительного канала человека, но и ее количество. При снижении количества эшерихий ниже допустимого уровня отмечается ухудшение всех вышеописанных процессов. При затянувшемся процессе формируется – нарушение микробного соотношения в пищеварительном канале.

Определить качественный и количественный в целом и кишечной палочки в частности можно с помощью развернутого бактериологического исследования (так называемый ) и .

Патогенные виды кишечной палочки

Среди патогенных штаммов кишечной палочки выделяют:

• энтеропатогенные;
• энтеротоксигенные;
• энтероинвазивные;
• энтерогеморрагические.

Для каждой группы характерна определенная клиническая симптоматика.

Источником инфекции при эшерихиозе может быть как больной человек, так и инфицированное животное. Среди возможных путей передачи на первом месте стоит пищевой, после него контактный и водный.

Энтеропатогенные виды кишечной палочки вызывают развитие (поражения тонкой и толстой кишки) у детей раннего возраста (в том числе и первого года жизни). Источником инфекции является взрослый человек (родственники или чаще всего медицинский персонал), наибольшую значимость имеет так называемый носитель. Передача инфекции осуществляется контактно-бытовым путем (через предметы обихода и медицинский инструментарий).

Энтероинвазивные виды кишечной палочки вызывают острые кишечные нарушения у детей более старшего возраста и у взрослых людей. Источником инфекции также является человек, ведущий путь передачи – пищевой. Среди возможных пищевых факторов передачи инфекции наиболее значимы:

• молочные продукты (кефир, ряженка, творог, простокваша);
• разнообразные салаты;
• мясные продукты (студень, холодец);
• напитки, не подвергающиеся термической обработке (квас, компот, соки в нестерильной таре).

Энтеротоксигенные разновидности кишечной палочки вызывают кишечные расстройства у детей дошкольного возраста. Наиболее распространены в странах с тропическим и субтропическим климатом, поэтому рассматриваются как возможный возбудитель так называемой . Наиболее характерный путь передачи – водный, так как для развития клинической симптоматики необходимо проникновение в организм человека достаточно большой дозы патогенного варианта кишечной палочки.

Энтерогемолитические разновидности кишечной палочки изучены меньше. Вызывают поражение пищеварительного канала у взрослых людей. Предполагаемый источник инфекции – крупный рогатый скот, а возможные факторы передачи – продукты животного происхождения, не проходящие достаточную термическую обработку (мясо с кровью, непрожаренный шашлык, молоко некипяченое).

Факторы размножения и роста

Размножению и росту бактерий способствует любая погрешность в выполнении санитарно-гигиенических правил:

• недостаточно тщательное мытье рук;
• употребление сырой водопроводной или колодезной воды;
• неправильное мытье посуды, овощей и фруктов (холодной водой, без моющего средства и без щетки);
• редкая смена нательного и постельного белья.

Все это приводит к попаданию кишечной палочки в пищеварительный канал и другие системы органов. Это вызывает развитие нарушений и тяжелых заболеваний репродуктивной и мочевыделительной сферы, а также нервной системы.

Симптомы заболеваний, вызываемых кишечной палочкой

Если патогенная кишечная палочка проникает в пищеварительный канал человека, то наблюдается такая клиническая симптоматика:

• продолжительная тошнота и повторные эпизоды рвоты;
• боль в животе умеренной интенсивности и разлитого характера;
• жидкий стул, иногда с примесью крови и слизи (при поражении инвазивными штаммами);
• ухудшение общего состояния (повышение температуры тела, слабость, снижение аппетита).

При поражении мочевыделительного тракта и репродуктивной сферы клинические проявления неспецифичны: доминирует болевой синдром. Кишечная палочка наиболее опасна, если попадает в кровь или центральную нервную систему. В этом случае развивается заражение крови (сепсис) или менингит (менингоэнцефалит). Развиваются тяжелые нарушения функций внутренних органов, которые могут привести к смерти больного.

Варианты обнаружения бактерии

Присутствие кишечной палочки допустимо только в пищеварительном канале. Можно даже сказать, что эшерихия обязательно должна выделяться из пищеварительного тракта здорового человека.

В других биологических жидкостях (кровь, моча, вагинальный секрет, мазок из уретры) кишечная палочка отсутствует.

Если кишечная палочка обнаружена в моче или вагинальном секрете (мазке из уретры), то следует повторить исследование. Вполне возможно, что сбор биологического материала был проведен с нарушениями: недостаточно тщательно помытые руки и половые органы или нестерильный контейнер. Если и при повторном обнаруживается эшерихия, то это свидетельствует о патологическом процессе. Как правило, наблюдаются и другие признаки воспалительных изменений. Лечение необходимо в соответствии с выраженностью клинических проявлений.

Худший вариант – обнаружение кишечной палочки в крови или спинномозговой жидкости. Это признак тяжелой генерализованной инфекции, требующий немедленного комплексного лечения.

Лечение

Лечение кишечной палочки зависит от локализации патологического процесса. Непосредственное воздействие на патогенный штамм эшерихии оказывают

КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА (ESCHERICHIA COLI)

Кишечная палочка (эшерихия коли, лат. escherichia coli; общепринятое сокращение E. coli) - вид грамотрицательных палочковидных бактерий, входящий в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.

Вид эшерихия коли (e. coli) входит в род эшерихии (лат. escherichia), семейство энтеробактерии (лат. enterobacteriaceae), порядок энтеробактерии (лат. enterobacteriales), класс гамма-протеобактерии (лат. γ proteobacteria), тип протеобактерии (лат. proteobacteria), царство бактерии.

Существует большое число разновидностей кишечной палочки (escherichia coli), в том числе, более 100 патогенных («энтеровирулентных») типов, объединенных в четыре класса: энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные и энтерогеморрагические. Морфологические различия между патогенными и непатогенными эшерихиями отсутствуют.

Кишечные палочки. Общие сведения

Кишечные палочки (escherichia coli) устойчивы во внешней среде, длительное время сохраняются в почве, воде, фекалиях. Хорошо переносят высушивание. Кишечные палочки обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств (хлорной извести, формалина, фенола, сулемы, едкого натра и др.). Кишечные палочки более устойчивы во внешней среде по сравнению с другими энтеробактериями . Прямой солнечный свет убивает их в течение нескольких минут, температура 60°С и 1 % раствор карболовой кислоты - в течение 15 минут.

Часть кишечных палочек имеет жгутики и подвижны. У других кишечных палочек жгутики и способность к движению отсутствуют.

Escherichia coli в кишечнике и кале человека

Число кишечных палочек escherichia coli среди других представителей микрофлоры кишечника не превышает 1%, но они играют важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Кишечные палочки являются основными конкурентами условно-патогенной микрофлоры в отношении заселения ими кишечника. Кишечные палочки забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных для человека бифидо- и лактобактерий. Кишечные палочки вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12, К, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных и жирных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция.

Escherichia coli в кишечнике человека появляются в первые дни после рождения и сохраняются на протяжении жизни на уровне 106-108 КОЕ/г содержимого толстой кишки. В фекалиях здорового человека кишечные палочки (типичные) выявляются в количестве 107-108 КОЕ/г, при этом количество лактозонегативных кишечных палочек не должно превышать 105 КОЕ/г, а гемолитические кишечные палочки должны отсутствовать.

Отклонения от указанных значений является признаком дисбактериоза:

- снижение типичных кишечных палочек до 105-106 КОЕ/г, или повышение содержания типичных эшерихий до 109-1010 КОЕ/г определяется, как первая степень микробиологических нарушений

- повышение концентрации гемолитических кишечных палочек до до 105-107 КОЕ/г определяется, как вторая степень микробиологических нарушений

Эшерихиозы

Патогенные серотипы кишечных палочек могут быть причиной эшерихиозов - различных инфекционных заболеваний, протекающих с интоксикацией, лихорадкой, обычно с поражением желудочно-кишечного тракта, реже - мочевыводящих, желчевыводящих путей, других органов или с развитием сепсиса. Эшерихиозы чаще встречаются у детей раннего возраста. Механизм распространения эшерихиозов ЖКТ - фекально-оральный. Чаще всего заражение происходит через загрязнённую пищу или воду.

Энтеропатогенная кишечная палочка

Энтеропатогенная кишечная палочка часто обозначается аббревиатурой на латинице - ETEC. Кишечные инфекции, вызываемые энтеропатогенными штаммами кишечных палочек, развиваются чаще всего в тонкой кишке у детей первого года жизни, в том числе у новорождённых. Заболевание сопровождается сильным поносом с водянистым стулом без примеси крови, выраженными болями в животе, рвотой. Энтеропатогенные escherichia coli являются частой причиной диарей в родильных домах. Штаммы ETEC являются основной причиной развития острой водянистой диареи в развивающихся странах, особенно в теплый и влажный сезон. Как в развитых, так и в развивающихся странах штаммы энтеропатогенной кишечной палочки являются наиболее распространенной причиной «диареи путешественников», которая обычно проходит без лечения.

Энтеротоксигенная кишечная палочка

Энтеротоксигенные кишечные палочки обладают способностью прикрепляться к эпителиальным клеткам слизистой оболочки тонкой кишки и продуцировать токсины, вызывающих диарею. Энтеротоксигенные кишечные палочки являются основной причиной острых диарей у детей и взрослых и наиболее частой причиной так называемой «диареей путешественников».

Энтерогеморрагическая кишечная палочка

Энтерогеморрагические кишечные палочки (EHEC) являются причиной геморрагического колита, а также тяжелого заболевания - гемолитико-уремического синдрома (микроангиопатической гемолитической анемии, сочетающейся с почечной недостаточностью; аббревиатура ГУС или HUS).

Для геморрагического колита характерно острое начало в виде сильных спастических болей в животе и водной диареи, которая вскоре становится кровавой. Лихорадка обычно отсутствует, но у некоторых температура тела может достигать 39 °С. В легких случаях геморрагического колита продолжается 7–10 дней. Приблизительно в 5 % случаев геморрагический колит осложняется геморрагическим синдромом, острой почечной недостаточностью и гемолитической анемией.

Источником инфекции мая 2011 года в Германии и других европейских странах являлся штамм продуцирующей шига-токсин STEC (синоним: продуцирующей веротоксин - VTEC) энтерогеморрагической кишечной палочки.

Заражение STEC или VTEC-кишечной палочкой происходит чаще всего через продукты питания или при близком контакте с больными людьми или животными. Для начала заболевания достаточно небольшого числа STEC/VTEC Escherichia coli.

Установлено, что возбудителем европейской инфекции мая 2011 года является кишечная палочка серологической группы E. coli O104 (серотип E. coli O104:H4), имеющая в своем геноме ген, ответственный за продукцию шига-подобного токсина 2-го типа.

Штаммы E. coli O104:H4, выделенные от пациентов, характеризовались резистентностью к бета-лактамным антибиотикам за счет продукции бета-лактамазы расширенного спектра, но оставались чувствительными к группе аминогликозидов (гентамицин) и фторхинолонам.

После заражения энтерогеморрагической кишечной палочкой инкубационный период длится чаще всего от 48 до 72 часов, но может быть и от 1 до 10 дней. Симптомы заражения включают схваткообразные боли в животе и диарею, нередко с кровью. Могут наблюдаться лихорадка и рвота. Большинство больных выздоравливают в течение 10 дней. Иногда инфекция может приводить к опасным для жизни состояниям, таким как гемолитико-уремический синдром.

Энтероинвазивная кишечная палочка

Энтероинвазивная кишечная палочка часто обозначается аббревиатурой на латинице - EIEC. Энтероинвазивные кишечные палочки являются причиной заболеваний, похожих по проявлению на бактериальную дизентерию (причиной которой являются шигеллы). Штаммы EIEC подобны штаммам Shigella как биохимически, так и серологически. Как и в случае Shigella, энтероинвазивные кишечные палочки проникают в эпителиальные клетки ободочной кишки и размножаются там. У больного отмечаются боли в животе, обильный водянистый понос с примесью крови.

В развивающихся странах штаммы EIEC встречаются редко. Они служат причиной возникновения периодических вспышек инфекций пищевого происхождения среди детей и взрослых. Симптомы заболевания имеют много общего с проявлениями шигеллёза. Предположительно против EIEC эффективны те же антибиотики, что и против Shigella при условии сохранения чувствительности этого штамма на той или иной территории, однако результативность терапии еще никогда не оценивалась в рамках контролируемых исследований.

Escherichia coli - возбудитель заболеваний мочеполовых органов

Инфицирование кишечными палочками (а также другими уропатогенными микробами, обитающими в кишечнике) мочеполовых органов, особенно у женщин, часто происходит непосредственно из желудочно-кишечного тракта при недостаточном соблюдении гигиены или применении специфических сексуальных практик.

Кишечные палочки являются причиной:

- около 80 % внебольничных инфекций мочевыводящих путей

- 64 % всех заболеваний острым простатитом

- 80 % всех хронических простатитов

- для пациентов старше 35 лет - большей части всех эпидидимитов (воспалительный процесс в придатке яичка), орхитов (воспаление яичка) и эпидидимоорхитов (сочетанное воспаление яичка и придатка яичка)

- 70-95 % инфекций мочевых путей, достигающих мочевого пузыря или почки восходящим путем

- других заболеваний мочеполовых органов.

Бактериурия - наличие бактерий в моче может являться признаком воспаления в мочевыводящих путях, мочевом пузыре, почках. При отсутствии каких-либо симптомов, истинная бактериурия (инфекция мочевых путей) диагностируется при наличии не менее 105 микробных тел кишечных палочек (или других энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи, иначе предполагается, что загрязнение мочи происходит при ее заборе. Если бактериурия не сопровождается какими-либо симптомами, тогда она называется бессимптомной. Бессимптомная бактериурия не всегда требует немедленного лечения.

При наличии симптомов или при заборе мочи катетером диагностический порог может быть значительно уменьшен. В частности, при наличии клинической симптоматики (лихорадка, озноб, тошнота, рвота, боли в поясничной области, дизурия) и выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи, критерием для диагностики острого пиелонефрита является наличие не менее 104 кишечных палочек (или других патогенных энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи. Острый цистит диагностируется при наличии соответствующей клинической симптоматики, выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи и обнаружении не менее 102 кишечных палочек (или других колиформных бактерий) в 1 мл мочи.

Штаммы Escherichia coli - пробиотики и компоненты лекарств

Штамм кишечной палочки Escherichia coli Nissle 1917 (DSM 6601) считается наиболее эффективным пробиотиком, помогающим уменьшить воспаление и оттянуть следующий приступ язвенного колита.

Специально подобранные штаммы эшерихии коли входят в состав лекарств: Хилак форте (штамм DSM 4087), Бификол (штамм М-17), Колибактерин (штамм М-17) и других.

Антибиотики, активные в отношении кишечной палочки

Антибактериальные средства, активные в отношении кишечной палочки: амоксициллин, левофлоксацин, нифурател, нифуроксазид, рифаксимин, фуразолидон, ципрофлоксацин.

Курсовая работа

Биологическая характеристика Escherichia coli

Введение

Эшерихиоз (escherichiosis) (колибактериоз) - Протекающая в острой форме бактериальная инфекционная болезнь молодняка сельскохозяйственных животных, включая птиц (в основном до 2-недельного возраста) проявляющаяся профузным поносом, признаками тяжелой интоксикации и обезвоживания организма.

Протекает в энтеритной, септической и энтеротоксемической формах. Установлено более 150 типов. У домашних животных и человека известно более десяти серотипов кишечной палочки, вызывающей колибактериоз.

Общепризнанно, что кишечная палочка обитает в кишечнике животных. Как правило, она не вызывает заболевания.

Материалом для выделения кишечной палочки являются объекты внешней среды (вода, почва, смывы с разных предметов), при заболеваниях - испражнения, рвотные массы, моча, дуоденальное содержимое или кровь, а также пищевые продукты, подозреваемые как источник заражения. Материал засевают на дифференциально-диагностические среды с последующим выделением чистой культуры E.coli. Идентификацию проводят путём изучения морфологических, биохимических и антигенных признаков. Заключительным этапом является определение биовара кишечной палочки, особенно серогруппы и серовара.

1.Историческая справка

кишечный палочка патогенность заболевание

Кишечные палочки

(Бактерии группы кишечных палочек) В 1885 г. Эшерих открыл микроорганизм, который получил название Escherichia coli (кишечная палочка). Этот микроорганизм является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека и животных. Кроме Е. coli, в группу кишечных бактерий входят эпифитные и фитопатогенные виды, а также виды, экология (происхождение) которых пока не установлена. К бактериям группы кишечных палочек относят роды Escherichia (типичный представитель Е. coli), Citrobacter (типичный представитель Citr. coli citrovorum), Enterobacter (типичный представитель Ent. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности морфологических и культуральных свойств. Они характеризуются различными ферментативными свойствами и антигенной структурой.

Впервые заболевание у телят установлено в 1891 году К. Иейсеном в Дании. В специальной литературе известно много синонимов, под которыми описывалась патология: колибациллез, колисепсис, колиэнтерит, коли-диарея, «белый понос телят», токсическая диспепсия. Патология имеет глобальное распространение, сопровождается большими убытками. В Германии заболеваемость колибактериозом телят в тридцатые годы достигала 42-48%., среди жеребят -19,7%. Во Франции в отдельные годы на некоторых фермах летальность животных составляла 40 - 55%. В США потери от колибактериоза определяются цифрой в 10%, к обшей заболеваемости телят. Заболевание молодняка с разными показателями наблюдаются во всех странах Европы, Азии и т.д. (Я.Е. Коляков, 1970).

В России заболевание регистрируется во всех регионах. В хозяйствах Амурской области в 1946-1969 годы среди телят, павших в первый день жизни, количество положительных лабораторных заключений на колибактериоз составляло 28,7%, к числу исследованных проб, среди телят в возрасте. 2-3 дней - 34%., 4-7 дней - 22,5%., 8-14 дней - 19,4%., 15-21 день - 14,3%. Исследовано 3829 проб патологического материала (Ю.П. Мозжухин, 1971). В Приморье за 1967-1970 годы на колибактериоз проведено 746 экспертиз, из которых от 38%, до 55%, каждый год были положительными (Е.А. Кирьянов, 1974). Летальность при отдельных вспышках болезни среди телят достигала 46,6%., а в среднем за год - 32%. (Е.А. Кирьянов, 1977, 1979). В Хабаровском крае при исследовании 258 проб, обработанных в 1972-1975 годы, число положительных подтверждений на колибактериоз телят составило 12,4%. Случаев колибактериоза среди поросят в эти годы не диагностировано (Е.А. Кирьянов, М.Ф. Соснин, 1978). На Сахалине в 1972-1976 годы количество положительных случаев диагностики колибактериоза телят находилось в пределах 2.1 - 46.2%. (Е.А. Кирьянов, В.Г. Курдюков и др., 1981). В Амурской области в 1972-1976, годы на колибактериоз, телят исследовано 1696 объектов, частота положительных результатов по годам колебалась в пределах 15,4-27,9%., среди поросят - 17,3-35%. Исследовано 287 трупов (Е.А. Кирьянов, И.Ф. Тютрин, 1981). Колибактериоз в зоне Дальнего Востока в анализируемые годы также регистрировался среди норок, птиц, кроликов.

2. Биологическая характеристика

.1 Морфологические свойства

E.coli - это мелкие (длиной 2 - 3 мкм., шириной 0,5 - 0,7 мкм.) грамотрицательные палочки с закруглёнными концами. Ультраструктура сходна с другими грамотрицательными бактериями. В мазках они располагаются беспорядочно, не образуют спор, перетрихи (жгутики отходят по периметру бактерии). Кишечные палочки подвижны. Некоторые штаммы имеют микрокапсулу, пили.

Кишечная палочка не образует спор.

2.2 Культуральные свойства

Температурный оптимум для роста эшерихий 37°С, pH 7,2…7,4, факультативный анаэроб к питательным средам неприхотлив.

При посеве на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА):

На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует.

На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой (см. Приложение 2).

При посеве на дифференциальные среды:

на среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины с темным металлическим блеском (Е. coli). (см. Приложение 3)

на среде Левина кишечные палочки дают окрашенные в цвет индикатора колонии, так как способны разлагать лактозу, входящую в эти среды.

на средах Хисса кишечная палочка может образовывать газ. На селективно-дифференциальных средах колонии принимают цвет, соответствующий окраске среды.

на среде Плоскирева - соответственно красные с жёлтым оттенком или бесцветные.

на кровяном агаре (КА) могут давать полный гемолиз.

2.3 Биохимические свойства

Кишечная палочка продуцирует многочисленные сахаролитические ферменты, быстро ферментирует глюкозу и другие углеводы, чаще всего с кислото- и газообразобразованием. Почти все биотипы кишечной палочки постоянно ферментируют манитол, арабинозу, мальтозу с образованием кислоты; свыше 90% штаммов - лактозу, сорбит; непостоянно - сахарозу, раффинозу, рамнозу, ксилозу, дульцит, салицин; как правило, не ферментируют адонит и инозит. E.coli не утилизирует цитрат аммония, малонат натрия, не растёт на сраде с цианистым калием, не редуцирует нитраты и нитриты, не расщепляет мочевину, не разжижает желатину, большинство штаммов образует индол и не выделяет H2S. Кишечная палочка даёт положительню реакцию с метилротом и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра: (Для постановки реакции Фогес-Проскауэра к 2,5 куб. см культуры бактерий добавляют в начале 1 куб. см 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола, а затем 0,4 куб. см 40%-ного водного раствора КОН, пробирку тщательно встряхивают и спустя 3-5 мин. учитывают результаты. При наличии в культуре ацетилметилкарбинола она окрашивается в розовый цвет - положительная реакция, окраска культуры в желтый цвет свидетельствует об отрицательной реакции, при сомнительной реакции культура окрашивается в светло-оранжевый цвет.). E.coli не синтезирует ферменты цитохромоксидазу и фенилаланиндезаминазу, непостоянно декарбоксилирует лизин, орнитин и дегидролизует аргинин. Свертывают молоко.

2.4 Антигенная структура

По антигенным, а главное, токсиногенным свойствам, различают два варианта E.coli:

условно-патогенные кишечные палочки;

патогенные палочки, вызывающие диарею.

Кишечная палочка содержит О-, К- и Н-антигены. О(соматические) - антигены у E.coli, связаны с липополисахаридом (ЛПС) клеточной стенки. Иммунохимическая специфичность О-антигена определяется составом гексасахаридов в повторяющихся звеньях концевого участка полисахаридной цепи, которая другим концом связана через 2-кето-3-дезоксиоктонат (КДО) с липидом А. Например, структура ЛПС одного из штаммов кишечной палочки представлена следующим образом:

Количество сахаров в одном и том же концевом звене, так же как и число детерминантных звеньев у разных серогрупп эшерихий, неодинаковое. Специфичность О-антигенов кишечной палочки обычно определяется в реакции агглютинации с О- или ОВ-агглютинирующими сыворотками на предметном стекле, реже другими методами.

К-антигенами обозначают поверхностные антигены, которые связаны с капсулой и с ЛПС кишечной палочки. Их подразделяют на A-, B- и L-антигены, отличающиеся друг от друга чувствительностью к высокой температуре и химическим агентам. Наиболее высокой устойчивостью к нагреванию (до 100°С в течение 2½ час), спирту и 1 н. раствору HCl обладает А-антиген, наименее устойчив L-антиген. У большинства кишечных палочек К-антигены представляют собой кислые полисахариды, содержащие уроновые кислоты. Некоторые К-антигены содержат только белок. E.coli, имеющие К-антигены, не агглютинируются гомологичной О-коли-сывороткой. Эта особенность присуща живым культурам и утрачивается после их кипячения или автоклавирования. Наличие К-антигенов устанавливается также в реакции адсорбции агглютининов и при иммуноэлектрофоретическом исследовании.

H-жгутиквые, или флагеллярные, антигены присущи активно-одвижным штаммам. Они связаны с белком-флагеллином и определяют иповую иммунохимическую специфичность кишечной палочки. H-антигены трмолабильны. Они полностью разрушаются при кипячении в течение 2½ часов.

У E.coli описано около 170 О-антигенов, 97 К-антигенов и 50 Н-антигенов. Штаммы кишечной палочки, снабжённые ресничками, содержат белковые реснитчатые антигены. Их обнаруживают в реакции гемагглютинации.

Кишечные палочки обозначаются по антигеннм формулам: на первом месте ставится номер О-антигена, на втором - К-антигена, на третьем - Н-антигена. Тип К-антигена указывается в скобках. Например, К(В) или К(L). Номера О-, К- и Н-антигенов разделяются двоеточиями. По антигенным формулам устанавливается принадлежность исследованного штамма к определённой серологической группе.

Эпизоотические вспышки колибактериоза наиболее часто вызывают патогенные штмпы эшерихий следующих серогрупп:

у телят - 08, 09, 015, 020, 026, 035, 078, 086, 0101, 0115, 0117, 0119, 0141, реже 02, 033, 041, 055, 0103, 0127, 0137;

у поросят - 06, 026, 033, 0101, 0136, 0139, 0141, 0142, 0149, 0152, 0157;

у ягнят - 04, 08, 09, 015, 020, 028, 035, 041, 078, 0101, 0137;

у птиц - 01, 02, 08, 015, 018, 026,055, 078, 0111, 0113, 0128, 0141.

2.5 Плазмиды

Кишечные палочки могут содержать различные плазмиды: профаг, фактор фертильности, колициногенный фактор, фактор резистентности, антигенный фактор, энтеротоксигенный фактор и другие. Профаги могут вызывать изменения отдельных признаков кишечной палочки, например, О-антигена (лизогения (от греч. lýsis - разложение, распад и…geneia - происхождение, создание), генетически обусловленная способность бактерий лизироваться с выделением бактериофага через ряд поколений после непосредственного заражения им. Теория лизогении разработана в 1950 французскими учёными А. Львовым и А. Гутман, показавшими, что лизогенное состояние связано с присутствием в клетках бактерий потенциально инфекционной структуры - профага. В каждом поколении лизогенных бактерий подвергается лизису очень небольшая часть клеток (~1 клетка на миллион) с освобождением от 70 до 150 частиц так называемого умеренного фага. Частота перехода профага в инфекционное состояние (индукция профага) может быть увеличена рядом агентов (например, ультрафиолетовыми лучами). После заражения бактериальной клетки умеренным фагом процесс инфекции может развиваться по одному из двух направлений: по пути литического цикла, который так же, как и при заражении бактерий вирулентными фагами, заканчивается лизисом клеток и выходом потомства фага в окружающую среду; по пути лизогенизации, когда в результате биосинтетических процессов в клетке вырабатывается иммунитет к инфицирующему фагу, фаговая ДНК включается в ДНК бактерии и в дальнейшем реплицируется вместе с ней как её составная часть (профаг), а бактерия выживает и становится лизогенной. Судьба клетки решается на первых этапах инфекции и зависит главным образом от времени формирования иммунитета. Если состояние иммунитета наступает раньше, чем развитие инфекции достигнет стадии, необратимо ведущей к лизису, то может щсуществиться лизогенизация. В геноме бактерий могут содержаться одновременно профаги нескольких разных фагов (пол и лизогения). В этом случае клетка обладает иммунитетом в отношении всех этих фагов. В результате лизогенизации может произойти изменение некоторых свойств бактериальной клетки (так называемая лизогенная конверсия), обусловленное приобретением бактерией новой генетической информации. Искусственно полученные лизогенные бактерии по своим свойствам не отличаются от лизогенных бактерий, найденных в естественных условиях. У небольшой части потомства лизогенной клетки происходит «исцеление» - потеря профага. Утратившие профаг клетки дают начало нелизогенным линиям. Частота этого процесса может быть увеличена, например, действием ультрафиолетовых лучей. Таким образом, лизогения. - сложная форма вирусной инфекции у бактерий, при которой от момента заражения бактерий фагом до лизиса клетки проходит большое число клеточных поколений).

F-плазмиды определяют половую полярность и вызывают образование половых ресничек (sex-pili). Col-плазмиды контролируют образование колицинов, подавляющих рост филогенетически родственных бактерий. R-плазмиды ответственны за резистентность E.coli к антибиотикам. Плазмида К88 контролирует синтез одноимённого антигена и нитей, определяющих адгезивные свойства энтеропатогенных и энтеротоксигенных кишечных палочек; плазмиды могут быть двух типов. Один из них определяет синтез термолабильного, другой - термолабильного и термостабильного энтеротоксина.

2.6 Токсинообразование

Кишечная палочка образует эндотоксин, связанный с ЛПС (липополисахаридом), который является частью О-антигена. Биологическая активность эндотоксина выражается неодинаково у разных серогрупп кишечной палочки. Токсические свойства эндотоксина определяются целой молекулой ЛПС, поскольку один липид или полисахарид малотоксичны. Эндотоксин поражает свёртывающую систему крови, вызывает феномен Щвартцмана и другие явления, обладает пирогенными, адъювантными, протективными и митогенными свойствами. В небольших дозах стимулирует, а в больших угнетает фагоцитарную реакцию.

Многие серогруппы E.coli продуцируют эндотоксины. Полагают, что одни серогруппы кишечной палочки вызывают холероподобную диарею у людей, другие только у животных (поросят, телят).

E.coli продуцируют два типа энтеротоксина. Термостабильный энтеротоксин инактивируется только после кипячения в течение 30 мин, медленно диализируется через целлофан, сохраняет активность при кислых значениях рН и после обработки трипсином и проназой. Молекулярный вес 103-104. Антигенными свойствами не обладает. Термолабильный энтеротоксин инактивируется после 30-минутного прогревания при 60°С, рН 4,0-5,0, под действием проназы и не диализируется. Антигенная специфичность термолабильных энтеротоксинов, продуцируемых разными серогруппами, и холерогена одинакова. Они стимулируют активность аденилатциклазы и вызывают накопление циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), что приводит к нарушению секреции и развитию острой диареи

2.7 Резистентность

Устойчивость E.coli к воздействию внешних факторов - обычная для аспорогенных бактерий. Во внешней среде (воде, почве) она выживает в зависимости от конкретных условий в течение нескольких месяцев. При нагревании во взвесях погибает при 55° через час, при 60° - через 15 мин, в 1% растворе фенола - через 10 мин, в растворе сулемы 1:1000 - через 2 мин. Кишечная палочка обладает избирательной чувствительностью к бриллиантовому зелёному и солям тетратионовой кислоты. На этом основано применение ряда селективных сред. Многие штаммы E.coli высокочувствительны к мономицину, канамицину, гентамицину.

2.8 Патогенность

Кишечные палочки - комменсалы толстого кишечника - могут вызвать гнойно-воспалительные процессы в органах и тканях при резком снижении резистентности организма.

Вирулентность кишечной палочки проявляется в адгезивности кишечной палочки, то есть прилипании к ворсинкам эпителия кишки, размножения в просвете тонкой и толстой кишки, пенетрации в клетки эпителия и во внутриклеточном размножении, а также в подавлении фагоцитарной активности макрофагов и полиморфно-ядерных лейкоцитов. Кишечные палочки - возбудители колиэнтеритов у молодняка и холероподобных заболеваний у взрослых животных - размножаются на поверхности эпителиальных клеток кишки. Кишечные палочки - возбудители дизентериеподобных заболеваний - проникают в клетки эпителия и размножаются в них. Проявление вирулентности кишечной палочки зависит от дозы бактерий, проникших в кишечник. Вирулентность кишечной палочки определяется в тканевых культурах, опытах на лабораторных животных при воспроизведении экспериментальных колиэнтеритов, пневмонии и других процессов. Пенетрационная способность устанавливается кератоконъюнктивальной пробой Шереня путём введения культуры E.coli на конъюнктиву глаза морской свинки.

E.coli может причинять значительный вред животному. Штаммы, обитающие в толстой кишке и являющиеся условно-патогенными, могут попасть за пределы желудочно-кишечного тракта и при снижении иммунитета и их накопления стать причиной различных неспецифических гнойно-воспалительных заболеваний (циститов, холециститов, коли-сепсиса и других). Такие болезни называются парентеральными эшерихиозами.

Диареегенные штаммы E.coli, которые попадают в организме извне, могут вызывать вспышки энтеральных (эпидемических) эшерихиозов.

Чаще всего от эпидемических эшерихиоза страдают новорожденные животные, у которых иммунная система ещё полностью не сформировалась; у них есть только IgG, полученные от матери через плаценту (а от грамотрицательных бактерий защищают IgM); кислотность желудочного сока низкая; нормальная микрофлора только формируется.

Но диареегенные эшерихии способны поражать животных и более старшего возраста, а также взрослых. Причём эшерихиоз может протекать, например, по типу холеры (энтеротоксигенные штаммы), дизентерии (энтероинвазивные штаммы), геморрагического колита (энтерогеморрагические штаммы). Иногда кишечные палочки вызывают колисепсис, перитонит, эндотоксический (септический шок). Кроме того, E.coli может быть причиной пищевой токсикоинфекции.

2.9 Патогенез

Своеобразие этой инфекции заключается в том, что возникновение и развитие заболевания определяются своеобразием защитных реакций у животных раннего возраста и в значительно меньшей степени зависят от свойств микроба-возбудителя и дозы инфекта. Большое значение в патогенезе возникновения болезни имеют изменения ферментативной деятельности желез желудочно-кишечного тракта, возникновение дисбактериоза, снижение антагонистических, ферментативных и витаминообразующих свойств микрофлоры кишечника Возникновение токсикоза при колиэнтерите обусловлено рядом причин. Наряду с колитоксином, выделяемым патогенными серологическими типами кишечных палочек и продуктами распада микробных тел, из кишечника всасываются токсические продукты, образующиеся из пищи в связи с нарушениями процессов переваривания и скорости продвижения ее в просвете кишечника. Эти токсические продукты и антигены кишечных палочек оказывают воздействие на нервные окончания и непосредственно на нервные центры, на стенки сосудов и ткани. Второй фактор, который имеет огромное влияние на клинические проявления токсикоза, - это изменение массы циркулирующей крови, что обусловлено резким спазмом артериол при значительном расширении капилляров и мелких вен. Одновременно в связи с расширением сосудов брюшной полости происходит перераспределение массы крови, депонирование ее в брюшной полости и создание малокровия в сосудах головного мозга, кожи, почек. Возрастающая проницаемость сосудов приводит к появлению отека тканей за счет перехода белков и жидкой части крови в межклеточные пространства. Нарастанию сгущения крови и ухудшению кровообращения способствуют также большие потери воды и солей с частым жидким стулом , рвотой, повышенным испарением с поверхности кожи, а также с дыханием. Все это приводит к нарушению кровообращения, ухудшению снабжения тканей кислородом, падению сердечной деятельности и снижению мочеобразования.

Повышение уровня калия у таких больных кратковременно и быстро сменяется прогрессирующим снижением его уровня в сыворотке крови на фоне усиленной потери калия с мочой и калом.

Определенную роль в развивающейся картине токсикоза играет почти постоянное и длительное падение функции коры надпочечников с уменьшением продукции и секреции глюкокортикоидных гормонов, регулирующих тонус сосудов, белковый и углеводный обмен, восстанавливающих нарушенную проницаемость клеток

2.10 Экология

Резервуаром кишечной палочки в природе является человек, животное толстая кишка которого заселяется разными биотипами этого микроба.

Количество E.coli в 1 г испражнений колеблется от нескольких миллионов до 1-3 млрд. особей. На протяжении жизни происходит многократная смена биоваров кишечной палочки в кишечнике. Определённую роль в этом процессе играет режим питания, перенесённые инфекции, лечение химиопрепаратами, антибиотиками и другие факторы.

3. Лабораторная диагностика

При обнаружении бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для Е. coli, биохимические свойства не изучают, а сразу исследуют в РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными сыворотками, вначале с комплексной, а затем при получении положительного результата с моновалентными сыворотками. Результат реакции учитывают в течение одной минуты. Контролем служат:

) исследуемая культура + физиологический раствор;

) культура + нормальная кроличья сыворотка, разведенная в соотношении 1:10.

Культуры, выросшие на МПА, проверяют с сыворотками К 88, 987 Р и А 20, культуры со среды Минка - с сыворотками К 99 и F41. При положитель РА культуры относят к возбудителям эшерихиоза и на этом заканчивают их дальнейшее изучение. При отсутствии эшерихий с адгезивными антигенами культуру идентифицируют на основании изучения ферментативных признаков. Для Е. coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы и неспособность утилизировать цитраты.

У культур, идентифицированных как Е. coli, устанавливают О-серогрупповую принадлежность как косвенный показатель патогенности или изучают патогенность в биопробе на белых мышах, цыплятах.

О-Серогруппу эшерихий устанавливают следующим образом. Культуры, выращенные на скошенном МПА при 37 0С в течение 18…20 ч, смывают физиологическим раствором, переносят в сухие стерильные пробирки, прогревают в водяной бане при 100 0С 1 ч для разрушения поверхностных термолабильных L- и В-антигенов или автоклавируют при 120°С 2 ч для разрушения термостабильного А-антигена. Прогретую взвесь бактерий центрифугируют при 2000…3000 мин-1 10…15 мин и осадок используют в качестве антигена для постановки РА на стекле. Оставшуюся часть антигена разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации клеток 5 108/мл и ставят пробирочную РА.

Определение серогрупповой принадлежности культур начинают с постановки РА на стекле с групповыми поливалентными сыворотками: на чистое обезжиренное стекло наносят по капле поливалентные сыворотки. В каждую каплю петлей вносят осажденную центрифугированием культуру и хорошо смешивают, результат учитывают в течение 3 мин. Положительная реакция характеризуется образованием мелкозернистого агглютината и просветлением жидкости. При отрицательном результате вся капля остается мутной.

Антиген, агглютинирующийся одной из поливалентных групповых сывороток, исследуют в РА на стекле с моновалентными сыворотками, разведенными в соотношении 1:10 и входящими в состав данной поливалентной сыворотки. Затем с моновалентной сывороткой, давшей положительную реакцию, ставят РА в пробирках в объеме 1 мл. Сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 до титра, указанного на этикетке: сначала готовят исходное разведение - к 2,4 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл сыворотки, в остальные пробирки разливают по 0,5 мл физиологического раствора, из исходного разведения переносят 0,5 мл смеси во вторую, перемешивают, из второй - в третью и т.д., из последней пробирки удаляют 0,5 мл смеси, из первой - 1,5 мл. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл антигена. Одновременно ставят контроли: 1) антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглютинации); 2) сыворотка, разведенная 1:25 без антигена (для исключения флокуляции). Все пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при 37°С 16… 18 ч и затем при комнатной температуре - 6…8 ч. Читают реакцию при помощи агглютиноскопа.

Результаты учитывают по общепринятому методу и обозначают в крестах (++++, +++, ++, +, -).

Для ускоренного метода диагностики и повышения частоты положительных результатов применяется метод люминесцирующих антител - модификация метода Кунса и Каштана (Coons, Kaplan, 1950). Мазок приготовляется либо непосредственно из кала (разведение в 5-10 раз-физиологическим раствором), либо после предварительного подращивания в течение 3-24 часов на среде Эндо или в жидком бульоне. После обработки специфической флюоресцирующей сывороткой при положительном результате в препарате при осмотре в люминесцентном микроскопе обнаруживается яркое свечение бактериальных клеток.

4. Лечение и профилактика

Лечение. Все мероприятия проводятся примерно так же, как и при сальмонеллезе. Сыворотка против кишечной палочки не всегда эффективна ввиду того, что она не всегда соответствует типу возбудителя колибактериоза. Наиболее эффективное воздействие оказывает пероральное использование хлортетрациклина гидрохлорида (по 0,01-0,02 г.), окситетрациклина (по 0,025 г.) или мицерина (по 0,01 г. на 1 кг живой массы).

Для лечения больных животных широко используют антибиотики (О. 3. Исхаков и др., 1984):

Ампициллин, Препарат применяют перорально индивидуально или групповым способом по 20 мг на кг живой массы 3 раза в день;

Биовит. Антибиотик назначают с кормом, водой, молозивом 2 раза в сутки в дозе 0,25 г. па кг живой массы. Курс профилактики -5-20 дней;

Витатетрин. С лечебной целью дают индивидуально по 40 мг на кг живой массы с интервалом в 12 ч. Курс лечения 5-7 дней;

Гентамицин. Антибиотик вводят внутримышечно в дозе 1,5 мг на кг живой массы в течение 5-7 дней;

Левомицетин. Назначают перорально по 20 мг на I кг живой массы;

Микс-10. Дают с кормом в дозе 3-4 кг на 1 т корма. Курс лечения 7-10 дней;

Норомандомиксин. Дозы телятам 100 мг на 1 кг живой массы. Антибиотик дают через рот. Курс лечения 7 дней;

Оримицин. Вводится внутримышечно, подкожно, внутри-брюшинно или медленно внутривенно в дозе 4-30 мг на кг массы животного 2 раза в сутки. Объем вводимого раствора 10-20 мл. Курс лечения 5-7 дней;

Полимиксина М сульфат. Дают внутрь 2-3 раза в день в виде водного раствора по 4 мг на кг живой массы;

Солвоветин. Вводится внутримышечно через 12 часов в дозе 0,15 мл на кг живой массы. Инъекции повторяют 5-7 дней;

Спектам В. Спектам вводят внутрь за 20-30 минут до выпойки молозива. Доза - 40-60 мг па кг живой массы животного 2 раза в день, 3 дня подряд.

Кроме антибиотиков, при колибактериозе показано применение сульфаниламидных препаратов: сельфапиридазина, фтазина, сульфадиметоксина, сульфамонометоксина, энтеро-септола, интестопана, мексаформа, невигрома и др. (Р.М. Салимов, 1985; В.А. Фортушный, 1985; В.И. Проданов, 1974; В.В. Митюшин, 1985; Л.И. Гершкович, 1966; В.А. Гу-мул и др., 1985). В последнее время для терапии телят, больных колибактериозом, предложены лерс и стартин, обеспечивающие лечебный эффект до 88 проц. (Н.И. Овсянов с соавторами, 1984; И.Д. Колесниченко с соавторами, 1985).

Меры борьбы и профилактика . При установлении диагноза больных телят изолируют, подвергают лечению. Родившимся телятам выпаивают но 80-100 мл гипериммунной сыворотки и по 10 мл колипротектана. Колипротектан дают в течение двух дней до 60 мл. Подстилку и навоз удаляют из помещения каждый день. Навоз складируют в отведенном месте для биотермического обеззараживания. Каждодневно также подвергают дезинфекции станки или клетки в телятнике-профилактории. Дезинфицируют инвентарь, навозные желоба, навозные проходы.

В секции, где содержатся больные телята, производят удлинение разрыва между переносными клетками. Обеззараживают воздушную среду помещения. Персонал, работающий в телятнике, обеспечивается спецодеждой и обувью. Посещение профилактория, телятника посторонними лицами не допускается. Центральной задачей борьбы с колибактериозом является создание нормальных условий кормления и содержания коров, а также обеспечение выращивания молодняка. В этой связи кормление коров должно осуществляться на основе биологически полноценных рационов. Животным в обязательном порядке устраивается активный моцион. Организация активного моциона коров служит мощным фактором, профилактирующим накопление плазмид, обладающих патогенностью п лекарственной устойчивостью.

Не меньшее значение в системе предупреждения распространения патогенных эшерихий имеет правильная организация отелов и выращивания новорожденных телят. Для отела коров на каждой ферме оборудуют двухсекционные родильные обеления из расчета 10-15%, мест от общего поголовья коров. В каждой такой секции сооружается по несколько боксов. Перед отелом проводят туалет и дезинфекцию кожного покрова коровы. Продезинфицированный бокс заправляют подстилкой хорошего качества. Отел принимают на чистую мешковину. Теленку в первый час после рождения с целью профилактики колибактериоза выпаивают 80-100 мл гипериммунной сыворотки, затем молозиво.

Выращивание родившихся телят организуют в боксах. Для этого профилакторий делят на 4 изолированные секции с отдельными входами, автономной вентиляцией и канализацией. В каждой секции устанавливают индивидуальные клетки. Секции заполняют за 3-4 дня. При использовании их соблюдают принцип «все пусто - все занято». Содержат в индивидуальных клетках 10 дней, затем из профилактории их переводят на групповое содержание. Стараются, чтобы телята в телятнике размещались посекционно в одной, двух групповых клетках. Освободившиеся в профилактории клетки и секцию подвергают механической очистке и дезинфекции. После этого в течение пяти дней секцию не занимают, дают ей «биологический отдых».

В хозяйствах проводят специфическую профилактику колибактериоза. Для этого глубоко стельных коров и нетелей вакцинируют гидроокись-алюминиевой, формол-тномерсаловой вакциной против колибактериоза телят и ягнят. Коров и нетелей иммунизируют за 1,5-2 месяца до отела внутримышечно двукратно с перерывом в 10-15 дней. Вакцинацией коров обеспечивается высокая концентрация антител в молозиве, которые защищают родившегося теленка от влияния патогенных эшерихий. Применение вакцины коровам снижает заболеваемость телят колибактериозом в 1,5-3 раза, смертность - в 5-10 раз (В.В. Кольчак, 1983).

Кроме этого, с целью профилактики болезни показано применение телятам сыворотки крови коров, взятой в том же хозяйстве, а также нормальных глобулинов, колифага. Положительное действие оказывает выпаивание ацидофильно-бульонной культуры, ацидофильного молока. Хороший эффект дает применение колибактерина, бифидумбактерина. Бифидумбактерин назначают по 2-3 дозы 2-3 раза в день в течение 3-4 суток Г.В. Гнатенко с соавторами (1983), глубоко стельных коров рекомендуют обрабатывать стрептомицином. Препарат в дозе 500 ЕД на 1 кг живой массы вводится внутримышечно по 2 раза в день 3 дня подряд. По их данным, заболеваемость телят, полученных от обработанных коров, снижается до 7,1%., нет летальных исходов. При отсутствии такой обработки заболеваемость телят достигает 80%., летальность - до 61%.

Заключение

Кишечная палочка, Escherichia coli, - мы не раз слышали это название в телерепортажах об эпидемиях недавних лет в некоторых российских городах (Иваново, Смоленск, Челябинск). Когда незнакомый с микробиологией человек слушает радио или смотрит подобные сюжеты по телевидению, у него создаётся впечатление, что кишечная палочка может принести человеку только вред, и что от неё нужно избавляться всеми возможными способами.

Но если присмотреться к этому микроорганизму повнимательнее, то мы увидим, что кишечная палочка может приносить много пользы человечеству, а её вредные влияния можно существенно ограничить надлежащими санитарно-гигиеническими мероприятиями и правильным лечением. Она является очень удобным объектом для приведения генно-инженерных и других исследований, призванных в будущем помочь в лечении пациентов с различными заболеваниями.

В нашей стране эти исследования ведутся не так активно, как в США, из-за недостатка финансирования таких работ, но если эта проблема будет в ближайшее время преодолена, то у российских учёных есть все шансы для открытия новейших методик лечения, связанных с использованием кишечной палочки (немалую роль здесь играет и огромный энтузиазм отечественных учёных, в том числе и заинтересованность современной научной молодёжи).

Список использованной литературы

1.Борисов Л.Б. Энтеропатогенные кишечные палочки и их фаги, Л., 1976.

2.БСЭ, стр. 366-368.

Гнатенко Г.В., Тупииа Л.Г. Ракицкий Д.Т. Опыт борьбы с колибактериозом телят. - Ветеринария, Киев: «Урожай», 1983, вып. 57

Гумул В.А., Афанасьев Л.А., Мауланов А. 3. Клиника и лечение колибактериоза телят. - Вестник с-х науки Казахстана, 1985, №2.

Кауфман Ф. Семейство кишечных бактерий, пер. с англ., М., 1959.

Кирьянов Е.А. Патогенная микрофлора жвачных животных. - В кн.: Борьба с болезнями сельскохозяйственных животных в Забайкалье и на Дальнем Востоке. Сб. науч. трудов Благовещенского СХИ, Благовещенск, 1974.

Кирьянов Е.А. Болезни телят и их профилактика в колхозах п совхозах Приморского края. - Владивосток, 1977.

Кирьянов Е.А., Соснин М.Ф. Эпизоотическая ситуация и проблемы здоровых стад животных в Приамурье. - Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных на Дальнем Востоке. Сб. науч. тр. Приморского СХИ, вып. 47, Уссурийск, 1978.

Кирьянов Е.А., Галиулина Р.В. Профилактика болезней молодняка сельскохозяйственных животных. - Владивосток, 1979.

Кирьянов Е.А., Тютрин И.Ф. Этюды по инфекционной патологии сельскохозяйственных животных. - Воспроизводство стада и ветеринарное здравоохранение в условиях интенсивного животноводства Дальнего Востока. Сб. науч. тр. Приморского СХИ, Уссурийск, 1981.

Кольчак В.В. Колибактериоз телят и меры борьбы с ним в хозяйствах Амурской области (метод, рекомендации). - Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1983,

Коляков Я - Е-, Гительсон С. С, Каврук Л.С. Колибактериоз телят. - М: «Колос», 1970.

Лурия С., Дарнелл Дж., Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970; Равин В.К., Лизогения, М., 1971.

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология, под ред. Л.Б. Борисова и А.М. Смирновой, с. 269-273, М., Медицина, 1994.

Медицинская энциклопедия, стр. 252.

Методы санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды, под ред. Г.И. Сидоренко, М., 1978.

Микробиология и иммунология, под ред. А.А. Воробьёва, с. 289-293, М., Медицина, 1999.

Минкевич И.Е. Бактерии группы кишечной палочки как санитарно-показательные микроорганизмы, Л., 1949.

Мозжухин Ю.П. К эпизоотологии колибактериозов телят и поросят в Амурской области. - В кн.: Материалы XIX научной конференции. Благовещенск, 1971

Овсянов Н.И., Овладеева М, А., Наумова К.Н. Препарат лерс при диарее телят. - Земля сибирская, дальневосточная, 1984, №2

Острые кишечные инфекции, под ред. Т.В. Перадзе, с. 73, Л., 1973.

Поздеев О.К. Медицинская микробиология, с. 351-357, М., Гэотар-мед, 2002.

Проданов В.И. Материалы к изучению желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят. - В кн.: Профилактика и лечение болезней молодняка сельскохозяйственных животных. М.: «Колос», 1974

Салимов Р.М. Лекарственные препараты при колибак-
териозе. - Земля сибирская, дальневосточная, 1985 .Табачник А.Л., Гиршович Е.С., Темпер Р.М. Энтеротоксигенные E.coli, Журн. микр., эпид. и иммун., №3, с. 31, 1977.

Фортушный В.А. Сульфагин при колибактериозе теляг. - Ветеринария, 1985, №9

Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.

Кишечной палочкой (Escherichia coli) учёные называют палочковидную условно-патогенную бактерию, которая способна нормально функционировать и размножаться только в условиях отсутствия кислорода. Была открыта в восемнадцатом веке Теодором Эшерихом, благодаря которому и получила своё название.

Бактерия имеет довольно много штаммов (разновидностей) и большинство из них считаются безвредными (они живут в кишечнике человека, участвуют в синтезировании витаминоподобных соединений, обладают бактерицидными свойствами по отношению к некоторым патогенным микроорганизмам), но встречаются и такие, которые могут вызывать развитие серьёзных проблем со здоровьем, начиная с нарушений работы ЖКТ и заканчивая развитием , поэтому лечение кишечной палочки должно быть качественным и своевременным.

Общие сведения

Безопасные штаммы этого микроорганизма обитают в кишечнике человека, при этом их количество варьирует от 10 6 до 10 8 КОЕ (микробиологический показатель – колониеобразующая единица) на один грамм содержимого кишечника. Сразу стоит рассказать о том, что бактерии заселяют организм человека в первые дни после рождения, поэтому кишечные палочки у грудничков появляются сразу, и в том случае если их количество не превышает норму, они приносят кишечнику пользу, а значит, лечить такое состояние не нужно.

Однако стоит помнить, что некоторые штаммы этого микроорганизма токсичны, особенно для детей и беременных женщин (кишечная палочка в моче при беременности может свидетельствовать о развитии острого или хронического инфекционного заболевания, угрожающего здоровью плода), так что очень важно вовремя диагностировать это состояние и назначить адекватное лечение.

Кишечные палочки бывают условно-патогенные (к которым относится гемолизирующая кишечная палочка) и патогенные. Учёные смогли выделить больше сотни патогенных штаммов этой бактерии, которые впоследствии были разделены на четыре основных класса, а именно:

• энтероинвазивные;
• энтеротоксигенные;
• энтеропатогенные;
• энтерогеморрагические.

Эти микроорганизмы могут стать причиной развития эшерихиозов – заболеваний инфекционного характера, которые по статистике чаще всего встречаются у детей и женщин (инфекция передаётся фекально-оральным путём в основном через пищу или воду).

Симптомы

Симптомы заражения кишечной палочкой проявляются по-разному, поэтому каждый класс патогенных бактерий необходимо рассматривать в отдельности. Состояние здоровья заражённого человека будет зависеть от того, в какую группу относятся и с какой скоростью размножаются кишечные палочки, симптомы заболеваний описаны ниже.

Энтеропатогенные бактерии

Энтеропатогенные микроорганизмы чаще всего встречаются у детей до одного года жизни и их присутствие, как правило, обнаруживается ещё в роддоме. Сопровождаются водянистой диареей, иногда рвотой, отказом от еды и беспокойным сном.

Энтеротоксигенные бактерии

Энтеротоксигенные кишечные палочки опасны тем, что могут прикрепляться именно к слизистой оболочке кишечника, чем существенно нарушают его работу. Инфекция передаётся через немытые руки или фрукты, поэтому симптомы жизнедеятельности кишечных бактерий в человеческом организме иногда называют «диареей путешественника», которая сопровождается водянистым поносом без крови, тошнотой, приступообразной болью в животе.

Энтерогеморрагические бактерии

Энтерогеморрагические эшерихиозы характеризуется диареей с примесью крови и сопровождаются развитием острой гемолитической анемии. Опасность заболевания состоит в том, что гемолитическая кишечная палочка разрушает кровяные тельца, а это может привести к летальному исходу (чаще всего болезнь поражает женщин). Характерным признаком заболевания является то, что в каловых массах обнаруживается большое количество слизи и примесей зеленоватого оттенка, при этом гемолизирующая кишечная палочка не вызывает повышения температуры тела.

Энтероинвазивные бактерии

Энтероинвазивные патогенные микроорганизмы вызывают боли внизу живота и обильный стул (иногда с примесью крови). Встречаются в основном у детей, временно нарушают работу иммунной системы. Следует сказать о том, что чёткой клинической картины эшерихиозов не существуют, пациенты жалуются на боли в животе (которые могут быть локализованы в любой его части), жидкий стул и рвотные позывы, следовательно, лечение кишечных палочек должно быть комплексным и обязательно проходить под контролем врача. Кстати говоря, лактозонегативная кишечная палочка не должна обнаруживаться в кале в слишком больших количествах (норма – 10 5), а увеличение этого показателя можно заметить даже самостоятельно, об этом свидетельствуют непереваренные кусочки пищи в кале и чередование диареи с запорами.

Кишечная палочка, как возбудитель заболеваний мочеполовой системы

В норме кишечная палочка в моче обнаруживаться не должна, но если при сдаче анализов она была там найдена, врач должен в срочном порядке заняться её лечением. Обычно этот микроорганизм обнаруживается врачами-гинекологами при осмотре беременных женщин, причём для многих наличие этого микроорганизма в микрофлоре влагалища становится сюрпризом. Обнаруженная кишечная палочка в мазке свидетельствует о начале развития воспалительного процесса одного или нескольких органов мочеполовой системы (существует вероятность того, что бактерия передаётся половым путём от одного партнёра к другому).

Нужно сказать о том, что кишечная палочка во влагалище, должна стать поводом к тому, чтоб из лаборатории, сразу же отправиться в кабинет к врачу. Дело в том, что она существенно ослабляет местный иммунитет и делает организм больного человека практически беззащитным перед другими опасными бактериями, например, перед протеусом или стафилококком, что в итоге может стать причиной развития или , следовательно, лечить это состояние должен только специалист.

Гемолизирующая кишечная палочка является причиной развития 80% заболеваний мочеполовой системы, к которым относится:

• острый и хронический (кишечная палочка в мазке при диагностике простатита обнаруживается практически в 65% случаев);
• воспаление яичников и у женщин;
• (если кишечная палочка в мазке на вагинит обнаруживается сразу, то лечение этого недуга проходит максимально быстро, а отсутствие адекватной терапии может стать причиной развития серьёзных проблем со здоровьем);
• (очень часто гемолизирующая кишечная палочка обнаруживается при диагностике пиелонефрита у беременных);
• кольпит и так далее.

На самом деле в гинекологии гемолизирующая кишечная палочка занимает особенное место, потому что при попадании во влагалище она провоцирует развитие ряда таких заболеваний, которые впоследствии приводят к бесплодию и трудно поддаются лечению. По этой причине врачи советуют делать профилактику и диагностику этого возбудителя (определяется кишечная палочка в мазке) хотя бы один раз в год.

Как лечить?

Лечить кишечную палочку должен врач, который вначале делает бактериальный посев и точно определяет штамм возбудителя. Интенсивность и длительность лекарственной терапии зависит от вида бактерии, её локализации и индивидуальных особенностей организма больного человека. В процессе лечения важную роль играет диета и приём пробиотиков – препаратов, нормализующих кишечную микрофлору. После окончания курса лекарственной терапии все анализы сдаются повторно.

Изобретение относится к биотехнологии, касается получения продуцентов для пробиотических препаратов - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов, используемых для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта. В штамм Escherichia coli М17 - продуцент для пробиотического препарата колибактерин - введена неконьюгативная, немобилизуемая плазмида p Сolap, несущая гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л. Полученный штамм лишен нежелательного адгезивного фенотипа инактивированием гена адгезина fimH пилей 1-го типа интеграцией гена устойчивости к канамицину - неомицину npt. Штамм E.coli М17 fim H::Kan/p Colap депонирован в ВКПМ под номером В-7448, Это позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Введенные в сконструированный штамм признаки стабильно сохраняются в популяции. Это облегчает получение стандартного препарата на основе штамма и гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. 4 ил., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма Escherichia coli, который может быть использован для получения пробиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Пробиотики (другие названия препаратов данной группы: нормофлоры, эубиотики, микробиотики) являются эффективным средством для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Дисбактериоз - это выраженное изменение в видовом и количественном соотношении микробов, которое проявляется в бурном развитии условно-патогенных микроорганизмов, в частности бактерий семейства кишечной группы (Enterobacteriaceae), и сопровождается различными болезненными проявлениями. Важной причиной дисбактериозов является применение антибиотиков и других противомикробных препаратов [Красноголовец В. Н. "Клиническое значение дисбактериоза кишечника, развившегося в результате применения антибиотиков". В кн. "Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства". М., 1967, с. 223 - 243]. В настоящее время в России известны препараты пробиотиков "Колибактерин" и "Бификол", которые получают на основе штамма Escherichia coli М17, который, по-существу, является производным штамма Е.coli, выделенного А. Ниссле и используемого для получения препарата "Mutaflor" (Германия) [Перетц Л.Г. "Сухой колибактерин. Новые методы диагностики, лечения и профилактики кишечных заболеваний". В кн. "Тезисы докладов Пленуму Уч. мед. сов. МЗ РСФСР". М., 1961, с. 52-54]. Однако, в отличие от исходного штамма штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу колицина B и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы [Шемчук Л.Ф. "Стандартизация колибактерина", автореф. канд.б.н., М., 1983, с. 16]. Другим недостатком штамма Е.coli М17 и его предшественника является наличие у них высокоадгезивного М н фенотипа фимбрий 1-го типа, необычного и нежелательного для кишечного штамма. Такой фенотип часто обнаруживается у выделяемых из макроорганизма штаммов при инфекции мочевыводящих путей и внутрибольничной пневмонии [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е. coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Недостатком штамма E.coli М17 является также чувствительность его к антибиотикам. Поэтому препараты на его основе не могут быть эффективными на фоне приема антибиотиков. Между тем одновременное применение антибиотиков и пробиотиков может предотвращать развитие дисбактериоза и тем самым повышать эффективность терапевтических мероприятий, сокращать сроки лечения. Задачей изобретения является создание штамма Е.coli - производного E.coli М17, который позволяет устранить упомянутые выше недостатки известного штамма Е. coli М17, а именно: пониженная антагонистическая активность, нежелательный адгезивный фенотип, чувствительность к антибиотикам. Технический результат состоит в конструировании штамма с повышенной антагонистической активностью, сниженной способностью к колонизации отличных от первичной интестинальной ниш в макроорганизме и с резистентностью к умеренным дозам антибиотиков пенициллинового ряда. Указанная цель достигается тем, что с помощью генетических и генно-инженерных методов конструируют штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap, который продуцирует колицин E1, устойчив к умеренным концентрациям ампициллина (до 150 ЕД/мл) и содержит инактивированный ген fimH, кодирующий фимбриальный адгезин. Штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7448. В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что инактивирование гена адгезина fimH пилей 1-го типа в геноме Escherichia coli штамма М17 и введение в штамм Escherichia coli М17 неконьюгативной, немобилизуемой плазмиды pColap, несущей гены продукции колицина E1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется чертежами, где: на фиг. 1 показана схема получения рекомбинантного штамма E. coli M17fimH::kan/pColap с дефектом в гене адгезина fimH пилей 1-го типа, на фиг. 2 - схема конструирования гибридной плазмиды pColap, на фиг. 3 приведены результаты исследования адгезивной активности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, на фиг. 4 - результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap. При получении штамма Е.coli М17 fimH::kan/pColap в качестве исходного использовали его ближайший аналог - штамм Е.coli М17. Для элиминации фимбриального адгезина, сообщающего клеткам Е.coli М17 нежелательный высокоадгезивный М н фенотип, получали рекомбинантный штамм, у которого в хромосомный ген fimH, кодирующий адгезин, был интегрирован ген устойчивости к канамицину-неомицину npt. С этой целью использовали плазмиду pCH103, производную плазмиды R6K, которая имеет pir-зависимую систему репликации и может поддерживаться только в штаммах, содержащих ген pir, обеспечивающий ее репликацию [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е.coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Плазмида pCH103 несет ген устойчивости к ампициллину и фрагмент хромосомы, содержащий гены fim-кластера, в котором целостность гена fimH нарушена вставкой гена устойчивости к канамицину (неомицину) npt. После трансформации ее в штамм Е.coli М17 она не может поддерживаться в клетках, и устойчивые к канамицину трансформанты могут возникать или при интеграции ее целиком в хромосому в результате одного кроссинговера или в результате двойного кроссинговера (фиг. 1). Трансформанты второго класса остаются чувствительными к ампициллину. Среди них был отобран штамм, обозначенный Е.coli M17fimH::kan (или М17 fimH::npt). Проведенное исследование подтвердило отсутствие у полученного штамма маннозо-чувствительной адгезии, т.е. FimH - фенотип. Для повышения антагонистической активности штамма Е. coli М17 и придания ему устойчивости к ампициллину на основе плазмиды ColE1 известными методами ["Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, с. 7-10, 39-44] была сконструирована гибридная плазмида pColap (фиг. 1). Исходная плазмида ColE1, выделенная из непатогенного штамма Е.coli, детально изучена. Она имеет довольно узкий круг хозяев (в основном - штаммы кишечной палочки) и стабильно поддерживается в бактериальных клетках. Известны ее полная нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина E1, который губительно действует на клетки родственных бактерий. Недостатком плазмиды ColE1 является ее способность к мобилизации в другие клетки с помощью конъюгативных плазмид, которая обусловлена присутствием в ее структуре mob-области. Используя эндонуклеазу рестрикции BspLu11.1, эту область полностью удалили и при этом практически не затронули другие генетические элементы плазмиды. Затем, используя эндонуклеазу рестрикции BspH1, из известного вектора pUC19 вырезали фрагмент, содержащий ген b1a, кодирующий синтез - лактамазы, и лигировали его с фрагментом плазмиды ColE1, лишенным mob-области. В результате получили плазмиду pColap. Эта плазмида неконъюгативна и немобилизуема и, следовательно, практически не может быть передана в клетки других бактерий. В отличие от вектора pUC19 и других плазмид pColap обеспечивает только умеренный уровень устойчивости к ампициллину трансформированным ею штаммам Е.coli (табл. 1). Такое ухудшение экспрессии гена - лактамазы наблюдается из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта) и 5" - участке, повышающем эффективность экспрессии , произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды pColap. Чувствительность штаммов, несущих pColap, к повышенным концентрациям антибиотика следует считать благоприятным фактором. Так, если по каким-либо причинам присутствие штаммов, содержащих эту плазмиду, в кишечнике пациента становится нежелательным или если в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм, то все клетки, содержащие ее, можно элиминировать из организма, применив высокие концентрации -лактамных антибиотиков. Плазмидой pColap трансформировали штамм Е. coli М17 fimH::kan и получили штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap. Штамм имеет следующие характеристики. Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами 1,5 - 2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар и агаризованный бульон Хотингера. Через 36 ч роста при 37 o C образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируются. Агаризованная минимальная среда М9 с глюкозой (0,2%). Через 40 ч роста образует колонии 1-2 мм в диаметре, серовато-беловатые, полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями. Мясо-пептонный бульон и бульон Хотингера. Через 18-24 ч роста при 37 o C наблюдается сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, характерный запах. Жидкая минимальная среда М9 с глюкозой (0,2 %). Через 20-24 ч роста с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах слабый или отсутствует. Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом. Отношение к температуре и pH среды. Хорошо растет при температуре от 30 до 42 o C и при pH 6,8 - 7,2. Биохимические свойства. Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, маннозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты и газа. Рамнозу, галактозу и арабинозу - со слабым кислотообразованием; салицин - с замедленным кислото- и газообразованием; рафинозу - только с кислотообразованием. Инозит не усваивает. Сероводород не образует; индол вырабатывает. Отношение к антибиотикам. Устойчив к ампициллину при концентрациях в среде до 150 мг/л. Продукция бактериоцинов. Продуцирует колицин E1. Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду pColap (5239 п.н.), детерминирующую устойчивость к ампициллину и синтез колицина E1. Штамм имеет антигенную формулу О2:L1:H6 и агглютинируется сывороткой при титре сыворотки не ниже 1:64000. Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют устойчивость штаммов, несущих различные плазмиды, к ампициллину, стабильность их признаков в процессе культивирования. Пример 1. Изучение роста штамма Е. coli М17 и его производных, содержащих плазмиды, на средах с разными концентрациями ампициллина (табл. 1). Исследуемые штаммы кишечной палочки (таблица 1) выращивались в течение 18 ч в бульоне Луриа (LB - 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) при 37 o C с аэрацией. Затем готовили последовательные разведения бактериальных культур до 10 -7 в физиологическом растворе и высевали каждую культуру на чашки с LA (LB + 1,6 % агар), содержащие ампициллин в следующих концентрациях (мкг/мл): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Оценку роста колоний производили через 18-24 ч. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, исходный штамм кишечной палочки М17 проявляет высокую чувствительность к ампициллину. Плазмида pUC19, содержащаяся в штамме М17/pUC19, которая явилась источником гена - лактамазы для сконструированной нами плазмиды pColap, придает бактериальной клетке устойчивость к концентрациям ампициллина до 2 г/л. В то же время плазмида pColap, содержащаяся в штамме М17 fimH::kan/pColap, обеспечивает устойчивость к концентрациям ампициллина не выше 150 мг/л. Таким образом, полученные штаммы обладают умеренным уровнем устойчивости к ампициллину. Пример 2. Исследование адгезивных свойств и определение адгезивного фенотипа штамма Е. coli М17 и его производных. Адгезивный фенотип определяли стандартным методом "исследования роста" . Из свежей культуры исследуемых штаммов бактерий готовили суспензию бактериальных клеток в физиологическом растворе с оптической плотностью 1.0 при длине волны 540 нм. Параллельно приготовили планшеты для микротитрования с плоскодонными лунками с иммобилизованными в лунках субстратами для адгезии, а именно: МН (дрожжевой маннан), РН (бычья РНКаза В) и БСА (бычий сывороточный альбумин). Затем бактериальную суспензию помещали в лунки и инкубировали в течение 40 мин. Несвязавшиеся бактериальные клетки тщательно отмывали физиологическим раствором. В лунки добавляли богатую питательную среду и инкубировали с постоянным перемешиванием при 37 o C в течение 2,5 - 3 ч до появления помутнения в лунках. Оптическая плотность в каждой лунке учитывалась на автоматическом ридере микропланшет (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA). В данном эксперименте исследовались следующие штаммы Е.coli: М17 - исходный штамм; М17 fimH::kan - штамм М17 с инактивированным геном адгезина fimH: М17 fimH: : kan/pPKL91 - штамм fimH::kan, трансформированный плазмидой pPKL91, содержащей регуляторный ген fimB, включающий экспрессию пилей 1-го типа бактериальной клеткой; штамм M17fimH::kan/pColap - штамм М17 fimH::kan, трансформированный сконструированной нами плазмидой pColap, несущей детерминанты устойчивости к ампициллину и продукции колицина Е1. Результаты исследования адгезивной активности штаммов Е.coli М17 и производных штамма Е.coli М17, оцененной с помощью метода "исследования роста", представлены на фиг. 3 (по оси ординат отложены значения оптической плотности при длине волны 540 нм; на оси абсцисс - исследуемые штаммы Е. coli: 1 - М17; 2 - М17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - М17 fimH::kan/pColap). Как видно из фиг. 3, исходный штамм Е. coli М17 хорошо связывается и с РНКазой B, и с маннаном, что указывает на МН адгезивный фенотип, нежелательный для интестинального штамма кишечной палочки. Полученный нами рекомбинантный штамм М17 fimH::kan проявляет нулевую адгезивную активность как сам по себе, так и после введения в него плазмиды, включающей экспрессию пилей 1-го типа. Нулевая адгезиная активность сохраняется в этом штамме и после введения в него плазмиды pColap (штамм М17 fimH::kan/pColap). Пример 3. Исследование стабильности признаков штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, детерминируемых плазмидой pColap. Сконструированная нами плазмида pColap обеспечивает продукцию колицина Е1 и устойчивость к ампициллину. Сохранение этих признаков зависит от стабильности поддержания плазмиды в клетках бактерий: утрата плазмиды сопровождается утратой соответствующих признаков. Определяли стабильность сохранения устойчивости к ампициллину и колициногенности полученных штаммов при культивировании их в жидкой питательной среде в отсутствие селективного агента на протяжении 100 генераций. В качестве положительного контроля использовали исходную плазмиду ColE1, а отрицательного - плазмиду pBR322, производную ColE1, не содержащую локуса cer, который влияет на стабильность плазмид. Культуры штаммов М17 fimH::kan/pColap, М17/ColЕ1 и M17/pBR322 выращивались в течение 18 ч с усиленной аэрацией при 37 o C в LB с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм М17/ColЕ1 выращивали в тех же условиях, но без ампициллина. Полученные культуры содержали примерно 10 o бактериальных клеток в 1 мл. Затем в пробирки с 10 мл LB (без добавленного антибиотика) вносили 10 мкл (10 6) соответствующей бактериальной культуры. Полученную суспензию выращивали, как описано выше. При таком культивировании бактериальные клетки успевали пройти 10 делений. Повторив эту операцию 10 раз, мы получили бактериальную культуру, прошедшую 100 генераций с момента первого засева в среду без селективного агента. Перед каждым засевом отбирались пробы бактериальной культуры и проверялись на наличие свойств устойчивости к ампициллину и продукции колицина. Для этого суспензии клеток рассевались на чашках с LA до получения отдельных колоний. Затем по 100 колоний каждого штамма проверялись на способность к росту на той же среде в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Кроме того, колонии проверялись на способность продуцировать колицин Е1. Для этого использовался тест с нанесением верхнего агара (Миллер Дж. "Эксперименты в молекулярной генетике", М. , "Мир", 1976, стр. 183-189). Тест заключается в следующем: на чашки с твердой питательной средой, содержащей 1,6 % агар, репликатором или зубочисткой перекалывают исследуемые колонии. Чашки инкубируют при 37 o C в течение 3 - 4 ч, индуцируют продукцию колицина облучением ультрафиолетом в течение 4-5 с и инкубируют в тех же условиях в течение ночи. Затем клетки лизируют парами хлороформа при комнатной температуре в течение 30 - 40 мин. Важно проследить, чтобы на следующем этапе весь хлороформ выветрился из чашки. Наслаивают на нижний слой агара 3 - 5 мл полужидкого (0,7 %) агара, содержащего 10 7 /мл бактериальных клеток тест-штамма Е. coli (чувствительного к колицину Е1). Инкубируют ночь при 37 o C. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap приведены на фиг. 2 (ColE1 соответствует штамму М17/ColЕ1, pBR322 - штамму M17/pBR322, pColap - штамму М17/pColap). Присутствие плазмиды в бактериальной клетке следует из сохранения ею исходных свойств (колициногенности и/или устойчивости к ампициллину). Результаты эксперимента (фиг. 2) свидетельствуют, что лишенная cer локуса плазмида pBR322 быстро элиминируется из бактериальной популяции при выращивании в среде, лишенной антибиотика, в то время как две другие плазмиды (исходная ColE1 и рекомбинантная pColap) стабильно наследуются клетками в этих условиях. Это свойство является одним из важным преимуществ нашей конструкции, поскольку, с одной стороны, облегчает получение стандартного препарата на основе штамма, содержащего pColap, а с другой стороны, гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. Промышленная применимость. Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма Escherichia coli М17 rimH::kan/pColap достаточно для повторного получения штамма с использованием стандартных методик, реагентов и оборудования, применяемых в генно-инженерных исследованиях.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap ВКПМ В-7448, используемый для получения пробиотического препарата.

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург, а также для получения специфических антител к вирусу Марбург и генно-инженерных вакцин против вируса Марбург